茯芪颗粒对肝纤维化低蛋白血症的药效学及机制研究-中药学专业论文.docxVIP

成都中医药大学 成都中医药大学 2012 级硕士学位论文 万方数据 万方数据 中文摘要 目的：在中医理论指导下，茯芪颗粒是根据解放军 302 医院临床经验方“茯白方”通 过处方优化、工艺及制剂筛选而成。处方由黄芪、茯苓、当归、楮实子、阿胶及发酵虫 草菌粉药味组成，临床研究初步确定该颗粒制剂具有一定的抗肝纤维化低蛋白血症的作 用效果。本研究旨在通过药效学实验，考察茯芪颗粒治疗肝纤维化低蛋白血症的作用和 探讨作用的分子机制，期望寻找茯芪颗粒抗肝纤维化低蛋白血症的作用靶点，为茯芪颗 粒临床治疗肝纤维化提供科学的实验依据和合理的治疗理论。 方法： ①茯芪颗粒制备工艺研究：采用现代制剂工艺技术，结合传统汤剂用药习惯，选择 适合的提取、浓缩及干燥条件，并考察颗粒剂的制备工艺，制备出可供质量控制检验及 用于药效学研究的茯芪颗粒制剂。 ②茯芪颗粒的质量控制：采用薄层色谱及高效液相色谱法，鉴别茯芪颗粒中主要药 物的有效成分及含量，确保茯芪颗粒质量稳定。 ③茯芪颗粒的药效学及机制研究：通过建立 CCl4 致小鼠、大鼠肝纤维化低蛋白血症 模型和 TAA 诱导大鼠肝纤维化低蛋白血症模型，采用卡介苗联合脂多糖诱导小鼠免疫 性肝损伤模型，考察茯芪颗粒对肝纤维化低蛋白血症的影响；同时，采用环磷酰胺诱导 小鼠脾淋巴细胞增殖反应低下模型，考察茯芪颗粒对小鼠免疫功能的影响。 结果： ①以中医药理论为指导，确定茯芪颗粒制剂处方，以黄芪、茯苓、当归、楮实子混 合加 8 倍量水进行煎煮 2 次，第一次煎煮时间为 1.5 小时，第二次煎煮时间为 1 小时， 合并煎煮液并浓缩，将所得浸膏进行干燥，打粉。再与过筛的阿胶粉及发酵虫草菌粉混 匀，加糊精制粒。 ②通过茯芪颗粒的薄层色谱分析，结果显示薄层板相同位置上存在与当归及楮实子 对照药材相一致的斑点；高效液相色谱分析以黄芪甲苷为主要考察指标，进行含量测定 及方法学考察，结果精密度、重复性及加样回收试验的相对标准偏差（RSD）均小于 3%；样品专属性结果显示，黄芪甲苷峰与其它组分色谱峰可达到基线的分离，而阴性 对照溶液中的色谱峰对其测定无影响。 ③肝功能检测：从生化指标分析，茯芪颗粒可降低 CCl4 致小鼠、大鼠肝纤维化及 I TAA 诱导大鼠肝纤维化引起的血清 ALT、AST、ALP 水平的升高，抑制 ALB、TP 水平 的降低，具有显著性差异（P0.05）。各给药组可不同程度地降低不同因素诱导肝纤维 化模型动物血清中 PC-III、IV C、LN、HA 水平，差异有显著意义（P0.05）。对 BCG+LPS 诱导免疫性肝损伤小鼠血清 ALT、AST、ALP 含量的升高，ALB、TP 水平的降低亦有 较强的抑制作用，存在显著差异（P0.05）。同时，茯芪颗粒可提高环磷酰胺诱导免疫 低下小鼠脾淋巴细胞增殖反应。肝组织病理学检查，不同化学因素诱导模型组动物肝组 织均出现纤维组织增生，且有肝小叶形成。给予茯芪颗粒不同剂量后，肝组织病理显示 肝纤维化程度显著改善。 ④作用机制初步研究：α-SMA 免疫组化测试结果表明阳性片细胞浆出现棕黄色，阴 性片无着色；蛋白印迹结果显示肝纤维化模型组 p-mTOR 及 HIF-1α 的蛋白表达降低， 且差异明显（P0.05），给予茯芪颗粒后，p-mTOR 及 HIF-1α 表达的含量较模型组升 高，具有显著性差异（P0.05）；TIMP-1 与 MMP-9 的 RT-PCR 分析表明 CCl4 诱导肝 纤维化模型组大鼠肝组织内 TIMP-1 的表达增强，而 MMP-9 蛋白表达显著降低，呈显 著性差异（P0.05）。相反，茯芪颗粒组大鼠肝组织内 TIMP-1 的表达呈现显著降低， 而 MMP-9 蛋白表达显著增强，差异显著（P0.05）。 结论： ①通过临床应用，选择茯芪颗粒制剂处方药材，确定黄芪、茯苓、当归、楮实子的 提取、浓缩方法，结合现代制剂工艺技术，将阿胶打粉后与发酵虫草菌粉混合，最终制 得颗粒剂。 ②采用 TLC 法鉴别了制剂中的当归、楮实子，采用 HPLC 法测定了茯芪颗粒中的 黄芪甲苷含量，实现了对茯芪颗粒的质量控制。 ③茯芪颗粒药效学及机制研究表明，茯芪颗粒可显著治疗不同因素导致的肝纤维化 低蛋白血症，其机制可能与调控 mTOR/p70S6K 信号通路有关。 [关键词] 茯芪颗粒；肝纤维化；低蛋白血症；mTOR/p70S6K 信号 II Abstract Study on pharmacodynamics and mechanism of Fu-qi granule on liver fibrosis hypoalbuminemia Objective: Fu-qi granule was preparation though the optimization, process