肺炎克雷伯氏菌耐受碳青霉烯类药物的调控机制-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 摘 要 为研究肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）耐受碳青霉烯类药物的调 控机制，我们从外膜孔蛋白基因 ompK35, ompK36 以及编码碳青霉烯酶的 beta- 内酰胺酶基因 KPC-2 的作用入手来探讨耐药性的变化。 主要过程和结果如下： 1．通过对同样携带 KPC-2 基因的肺炎克雷伯氏菌的 ompK35/K36 基因测序，来 检测这些菌株之间的耐药性差异是否和膜孔蛋白基因有关。结果发现了多种 不同的 ompK36 序列型，临床分离菌株中造成细菌对于比阿培南（biapenem） 耐药性的主要基因突变是 ompK36 基因上第 134-135 的甘氨酸-天门冬氨酸出 现重复（GD 重复）。 2．通过实时 PCR 技术检测菌株 KPM1026 和其突变体 KPM1027 中 ompK35 和 ompK36 的表达量差异，我们发现在 KPM1026 中 ompK35 和 ompK36 的表达 比 KPM1027 高。进一步实验表明， KPM1027 中的孔蛋白基因正向调控因 子 ramR 基因出现移码突变，从而导致 ompK35 基因的表达水平下降。 3．从携带 KPC-2 基因的菌株 KP1004 和 KP1008 以及不携带 KPC-2 基因的菌株 KPM1026 和 KPM1027 中筛选耐受比阿培南或美罗培南突变体，对这些突变 体进行 ompK35/36 基因的序列分析，检测美罗培南（meropenem）对于这些 菌株的最低抑菌生长浓度（minimum inhibitory concentration, MIC），结果表 明孔蛋白基因的突变会使菌株的耐药性明显增加。 4．选取不携带 KPC-2 基因的 KPM1026 和 KPM1027 及其得到的 ompK36 基因 的突变体 KPM1171 和 KPM1176 作为受体菌，携带 KPC-2 基因的菌株作为 供体菌，进行细菌接合实验。通过选择美罗培南耐药性将 KPC 基因导入受 体菌株。结果表明，ompK36 基因上的单一突变大大增加受体菌株对于碳青 霉烯类药物的耐受性。5．将来自菌株 KPM1026，KP1004 和 KP1064 的 ompK36 基因克隆到表达载体 pRX，将重组质粒转化菌株 KP1074，通过检测对比阿 培南的耐药性，进一步表明含有或不含有 GD 重复的 ompK36 基因序列类型 对于该抗生素耐药性的效应。 关键词：肺炎克雷伯氏菌；孔蛋白；碳青霉烯 I II Abstract In order to understand the mechanism of Klebsiella pneumoniae resistance to carbapenem drugs, we studied the functions of outer membrane protein genes ompK35, ompK36 and beta-lactamase gene KPC-2, which encodes a carbapenemase. The main procedures and results of this project are summarized below: By sequencing ompK35/K36 genes of K. pneumoniae strains carrying KPC-2 gene, the relationship between drug resistance and the porin genes among these strains was examined. Our studies discovered the presence of several types of ompK36 gene sequences. Among K. pneumoniae clinical isolates, the main mutation that caused resistance to biapenem was the repeat of amino acids #134-135, glycine and aspartic acid (GD repeat). Through quantitative real-time-PCR we tested the expression of ompK35/36 genes in strain KPM1026A and its mutant KPM1027. We found that in KPM1026A the expression level of both ompK35 and ompK36 was higher