补骨脂对牙周炎大鼠牙移动保持期OPG表达影响.docVIP

补骨脂对牙周炎大鼠牙移动保持期OPG表达影响 　　【摘要】 目的：观察牙周炎大鼠牙移动保持期间，采取灌胃补骨脂水煎液对牙周组织中OPG表达情况。方法：按照随机数字表法将45只建立牙周炎的雄性大鼠分为三组，每组15只。空白对照组：建立牙移动模型后处死。实验组和阴性对照组：牙移动模型建立后去除拉簧，安放保持装置，各保持3、7、14、21 d。实验组在保持期内灌胃补骨脂水煎液，阴性对照组灌服等量生理盐水。制作免疫组化切片，观察上颌第一磨牙远中侧牙周组织OPG的表达情况。结果：阴性对照组在早期变化不显著，3 d后不断增加，实验组在整个保持阶段OPG的表达呈不断增加的趋势。在同一时段进行对比，实验组OPG的表达均明显大于阴性对照组，差异有统计学意义（P 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂与仪器 每1 000 mL水中加100 g补骨脂干燥果实（购自陕西，经黑龙江中医药大学中药研究所鉴定符合2015版《中国药典》补骨脂质量控制标准）浸泡30 min，加热至沸腾半个小时后滤渣，将滤液浓缩至100 mL，即制成100%浓度的水煎剂，备用（含1 g生药/mL）。DAB显色剂、兔抗多克隆一抗（武汉博士德生物工程有限公司），二抗PV6001（北京中杉金桥生物科技有限公司）。 　　1.2 实验动物 选用8周龄健康雄性Wistar大鼠50只[购于佳木斯大学动物实验中心，许可证号：SCXK（黑）2013-001]，体重（220±20）g，适应环境1周后开始实验，最终纳入45只。 　　1.3 方法 　　1.3.1 分组 按照随机数字表法将45只建立牙周炎的大鼠分为3大组，每组15只，共9小组。空白对照组：将建立牙周炎后的大鼠牙移动21 d后处死。阴性对照组和实验组：各4小组（每一保持时间点设置1小组），牙周炎大鼠牙移动21 d后去除加力拉簧，在上颌左侧第一磨牙与前牙间安放保持器，分别保持3、7、14、21 d，于保持前1 d以补骨脂水煎液开始灌胃实验组大鼠，剂量为5.6 g/kg（约5.6 mL），1次/d，直到处死。无菌生理盐水等量灌胃阴性对照组大鼠。 　　1.3.2 动物实验模型的建立 　　1.3.2.1 建立大鼠牙周炎模型 以10%水合氯醛（佳木斯大学口腔医院药房提供）腹腔注射大鼠（3.5 mL/kg），动物安静后仰卧于操作台，拴牢头部和四肢，用自制开口器暴露视野，使用快速手机在大鼠双侧第一磨牙颈部颊腭方向靠近龈缘的地方制备一0.2 mm深固位沟，用0.2 mm结扎丝（正畸用型号）分别围着大鼠第一磨牙颈部一圈实施结扎，在腭方结扎并将结扎头尽量埋入龈沟里，待大鼠清醒后饲以高糖饮食4周。每天检查，如有损坏丢失及时重置。 　　1.3.2.2 建立大鼠牙移动模型 参照林鹏等[6]的方法，在大鼠上颌两颗前牙的唇舌面以及远中侧距离龈缘约0.5 mm处用快速手机磨出约0.2 mm的深沟。用0.2 mm正畸钢丝穿入镍钛拉簧后，一端通过前两颗磨牙之间于腭侧结扎，另一端嵌入中切牙固位沟内，用测力计测量，对第一磨牙向近中施加约50 g力后唇侧结扎，并用玻璃离子固定，连续牵拉21 d后去除拉簧。每天检查口内装置，如有损毁丢失应及时重置。 　　1.3.2.3 建立牙移动后保持模型 牵引21 d后去除大鼠口内装置，以上颌左侧牙弓作为保持侧，在左侧第一磨牙与中切牙间，使用0.25 mm正畸钢丝安放保持装置，右侧不保持。分别保持3、7、14、21 d，每一时间点处死5只，保持期间每天检查口内装置，如有脱落及时补救[7]。 　　1.3.3 免疫组化 以过量水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉处死，解剖取出含磨牙区的上颌骨，修剪后固定于4%多聚甲醛液（北京鼎国昌盛生物技术有限公司，编号：AR-0211）24 h。之后浸泡于10%EDTA液（广州行知生物科技有限公司，编号：AAPR16-500）中于4 ℃脱钙约50 d，PBS冲洗干净组织块后石蜡包埋。以平行牙体长轴，从腭侧向颊侧的方向进行切片，获取近远中方向切片，选择断面为完整牙周韧带进行观察。OPG表达量以平均光密度（OD值）代表，每例牙根远中侧随机分析3个不同的高倍镜视野，取其平均值，该值越大，代表OPG表达越强。 　　1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。采取多因素方差方法分析比较时间和药物因素对OPG表达量的影响，LSD多重检验方法对各组内不同时间段OPG表达量分析对比，P 　　骨保护素（osteoprotegerin，OPG）亦名OC生成抑制因子，经分子克隆技术发现的一种与骨密度调节有关的分泌性糖蛋白，是TNF超家族的一种受体。OPG可作为诱饵与RANK竞争性的结合RANKL，导致与OC表面