结肠癌特异性噬菌体多肽筛选与鉴定的初步研究-遗传学专业论文.docxVIP

中文摘要结肠癌特异性噬菌体多肽筛选与鉴定的初步研究 中文摘要 结肠癌特异性噬菌体多肽筛选与鉴定的初步研究 研究生：俞杨 导师：张建琼教授 (东南大学发育与疾病相关基因教育部重点实验室，南京，210009) 中文摘要 结肠癌是一种严重危害公众健康的常见恶性肿瘤。其病因尚未完全清楚，目前认为是环境因素 与遗传冈素综合作用的结果。其发病率以北美洲最高，约24—34／10万；在中国，东南沿海明显高于 北方。近20多年来，世界大多数国家结肠癌发病率呈上升趋势；由于饮食结构的西化，中国结肠癌 发病率的上升趋势也十分明显。而且，结肠癌的中位发病年龄在我国比欧美提前约十年，年轻人患 病比欧美多见。结肠癌的起病隐匿，早期症状多不明显，易被忽视，从而影响了早期诊断。临床上， 不少病人在明确诊断后己经失去了根治机会。由于早期诊断的困难，目前结肠癌的手术治疗以改善 全身状态的始息性手术为主；放疗的损伤和化疗的不敏感也限制了其疗效，而免疫治疗对结肠癌的 疗效尚未明确。目前，寻找结肠癌新的特异性结合配体的尝试为其有效的诊断和治疗提供了希望。 本研究利用人结肠癌细胞系HT一29，对两种噬菌体展示的随机多肽文库(fUSE5／6一met和 fUSE5／15一mer)进行了亲和筛选。之所以采取全细胞直接筛选的策略，是因为这种筛选方法与传统 的纯化靶分子筛选相比，其作用方式更加接近天然的生物学状态，是一个不加选择压力的随机筛选 过程，阏此尤其适合于筛选诸如肿瘤细胞这样表面复杂度高、变异性强的细胞。为了筛选出与HT-29 结合的高亲和力特异性噬菌体多肽，本研究将筛选条件进行了优化。在第一轮筛选中，选用了10 7以 上的细胞数量和不严格的洗涤条件，以避免低含量的特异性克隆因强洗涤而丢失。待扩增之后，在 后两轮的筛选过程中逐渐降低细胞数量，并增加洗涤次数，力争得到高亲和力的特异性噬菌体多肽。 经过二轮“吸附一洗脱一扩增”的筛选过程，可以看出，从肿瘤细胞上洗脱下来的噬菌体滴度呈现出 明显增加的趋势。在两种不同的多肽文库中，噬菌体滴度从第一轮到第三轮分别增加了208倍和1250 倍，说明特异性的噬菌体多肽得到了富集。进一步细胞结合实验的鉴定结果也证明|『这个结论。而 且，经过反复的实验未检测到被细胞内吞的噬菌体多肽克隆。随后从三轮筛选的两个次级库中分别 挑取了50个单克隆，细胞结合实验证实这些克隆均能不同程度地与HT一29结合。 为了进一步说明这些单克隆是否具有与结肠癌细胞结合的肿瘤特异性，首先进行了细胞水平的 鉴定。由于缺乏正常结肠的细胞系，因此利用同为消化道上皮起源的人肝脏正常上皮细胞L—02作为 对}!{{。本研究用了两种策略米验证多肽克隆在细胞水平的肿瘤特异性：一是赢接鉴定，即直接通过 细胞结合实验筛选山与HT 29结合而不与L一02结合的克隆：二是先负筛再鉴定，即首先利用L一02 进行消减筛选，选取在筛选中不与【。02结合的次级库，再挑取单克隆，分别与IIT一29和L—02做细 胞结合实验。通过第一种方法，从与HT一29结合能力较强的克隆中直接鉴定出了某些6肽和15肽克 隆不与L 02结合。利用负筛的方法，也得到了一些与HT一29结合而不与L—02结合的克隆。由于HT一29 东南大学硕士学位论文是恶性程度较低的未转移肿瘤，为了考查这些克隆是否能结合恶性程度不同的结肠癌细胞系，本研 东南大学硕士学位论文 是恶性程度较低的未转移肿瘤，为了考查这些克隆是否能结合恶性程度不同的结肠癌细胞系，本研 究还选取了恶性程度较高的SW-480和转移性肿瘤LOVO做细胞结合实验。结果表明，在以上得到的 克隆中有相当一部分克隆可以结台恶性程度不同的结肠癌细胞系。随后，对得到的这些克隆进行测 序，但是测序结果未能对多肽的氨基酸组成给出具体的信息。综合各种实验结果，提示存在空间构 象影响测序的可能性。为了在组织水平对这些噬菌体多肽克隆的结肠癌细胞的肿瘤特异性进行评价， 本研究用获得的噬菌体多肽克隆做了免疫组化染色，筛选出了能够结合结肠癌组织而不结合对应癌 旁组织的噬菌体多肽克隆15merl9C。在此基础上，进一步选取了30对结肠癌和癌旁一一对应的临床 组织标本的石蜡切片扩大样本量，结果表明15merl．qC克隆不与任何一例正常组织结合，且可以较为 有效地区别其中17例结肠癌和对应的癌旁组织标本。同时，本研究还发现这一克隆在同为消化道恶 性腙上皮起源的胃癌组织中存在一些交叉反应，这表明其结肠癌的特异性是相对的。为了考查 15merl9C克隆是否会在机体内与其它的正常组织结台，本研究利用小鼠体内实验检测了该克隆在体 内的生物学分布。将l 2×10”TU的噬菌体多肽15merl9C从尾静脉注入小鼠，测定不同脏器的噬菌 体滴度。结果发现，噬菌体滴度最高的器官是脑和大肠，最多也只有