姜黄素和曲古菌素A调节Raji、NB4细胞表观遗传修饰作用的研究-内科学血液专业论文.docxVIP

华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 博士研究生学位论文 姜黄素和曲古菌素A调节Raji、NB4细胞 表观遗传修饰作用的研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院血研所 博士研究生李新刚 导 师陈燕教授 摘 要 表观遗传学(epigenetics)是指非基因序列改变所致可遗传的基因表达水平的 变化。表观遗传修饰是基因表达的主要修饰方式，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰 化和RNA干扰等。正常体细胞中启动子和5’调节区附近的胞嘧啶．鸟嘌呤二磷酸核 甘(CpG)岛通常是未甲基化的，而在肿瘤转化期间，常染色体基因发生cpG岛广 泛甲基化，并导致基因沉默。组蛋白高乙酰化使染色质呈开放状态，是转录活化所 必需的。一般说来，染色质高乙酰化区域是转录活跃的，而低乙酰化区域则是沉默 的。在转录调控上，表观遗传起到极为重要的作用，组蛋白高乙酰化和DNA低甲 基化可促进基因表达，而组蛋白去乙酰化和DNA高甲基化可抑制基因表达。组蛋 白乙酰化、DNA甲基化和RNA干扰这三种分子机制互相协调，实现对基因表达的 精确调控。近几年研究表明，表观遗传改变在肿瘤发生中扮演一个重要角色，肿瘤 发生的主要表观遗传改变是抑制肿瘤生长的基因发生DNA过甲基化和染色质中的 组蛋白去乙酰化修饰。并发现，甲基化转移酶抑制剂和去乙酰化酶抑制剂可以抑制 肿瘤细胞增殖，诱导分化和凋亡。本文研究姜黄素和曲古菌素A(TSA)对恶性淋 巴瘤细胞Raji和急性早幼粒细胞白血病细胞NB4去乙酰化酶的作用，以及对组蛋 白H3和非组蛋白P53的乙酰化水平调节，与细胞周期素依赖性激酶抑制剂P21启 动予位点相关基因乙酰化作用间的相关性，探讨姜黄素和TSA的表观遗传修饰作 用与抗恶性血液病的机制。 第一部分 姜黄素和TSA诱导Raj i、NB4细胞 蛋白质乙酰化作用的对比研究 华中科技大学同济医学院 华中科技大学同济医学院 博士研究生学位论文 背景和目的姜黄素是中药姜黄的有效活性成分，是近年发现的抗肿瘤新药，在体 内外有明显的抗肿瘤细胞增殖作用。我们在以前研究中发现，姜黄素可以抑制HL一60 细胞周期素cyclinD3表达和周期阻滞。但姜黄素和TSA对Raji、NB4细胞蛋白质 乙酰化作用与其增殖关系的研究较少。本文研究姜黄素和TSA对Raj i、NB4细胞去 乙酰化酶HDACI的作用和组蛋白H3、非组蛋白P53的乙酰化作用，探讨表观遗传修 饰作用与姜黄素和TSA抗肿瘤细胞增殖作用的相关性。 方法取生长良好的Raji、NB4细胞，分别用50mol几，259mol／L，12．5啪ol／L， 6．25¨mol／L，3．125№01／L姜黄索作用24h和36h，48h，以及300noml／L、150noml／L、 75noml／L、37．5noml／L、18．75noml／L的TSA作用24h、36、48h，MTT法测定姜黄 素和TSA的抗增殖作用，western blot实验测定HDACl表达变化和组蛋白H3、非 组蛋白P53的乙酰化水平变化。 结果 (1)姜黄素以时间和浓度依赖方式抑制NB4、Raji细胞增殖。在24h、36h 和48h的姜黄素抑制NB4细胞增殖的Ic50值分别约为40Pmol／L、25umol／L和 189mol／L，对Raji细胞IC50值分别为35¨nol／L、25 1#aol／L和20IJmol／L。(2)曲 古菌素A和姜黄素一样对NB4、Raji细胞增殖抑制作用呈现时间和浓度依赖性。 随着浓度增加和时间延长，TSA对NB4、Raji细胞增殖抑制作用明显增强，在24h、 36h和48h的对NB4细胞IC50值分别约为150nmol／L、100nmol／L和80nmol／L，对 Raji细胞ICso值分别约为150umol／L、90nmol／L和75nm01／L。(3)姜黄素明显抑 制NB4、Raji细胞HDACl的活性，在浓度为25Pmol／L时，4h后HDACI开始下降， 12h明显降低，持续48h；不同浓度姜黄素作用24h，在3．125¨mol／L的浓度时HDACl 水平未见明显减低，在6．25№nol／L时可引起HDACl水平降低，但在25～50Pm01／L 时HDACl降低水平未见明显区别；(4)姜黄素在25¨mol／L作用NB4、Raji细胞10h， 和空白对照组相比组蛋自H3的乙酰化水平升高，分别增加了2．4和2_3倍；TsA作 用组H3乙酰化改变更明显，分别增加了5．1倍和4．8倍；(5)姜黄素25umol／L作 用NB4细胞24h，P53蛋白水平明显增加，同时，乙酰化P53的水平也是明显上升 的，增加了16．5倍；在Raji细胞25m01／L姜黄素作用24h，P53的表达水平降低， 而乙酰化P53未检测出。TSA明显能调节P53的乙酰化水平，上升了