胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及鉴定-中西医结合基础专业论文.docxVIP

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体 胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体 的构建及鉴定 摘 要 目的：利用RT-PCR技术制备大鼠胶质细胞源性神经营养因子(gliat cell lme．derived neurotrophic factor，GDNF)的cDNA片段，利用基因重 组技术将GDNFcDNA克隆到pAdTrack．CMV中，构建GDNFcDNA重组 腺病毒载体，为后续的缺血性脑损伤基因治疗的研究做准备。方法：1．从 美国国家医学图书馆互联网核酸数据库检索到GDNFcDNA序列，设计 GDNF的上、下游引物，预计扩增片段653bp。2．取新生大鼠纹状体组织 提取总RNA，紫外分光光度法测定和甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定后，以提取 的总RNA为模板，GDNF的上、下游引物做RT-PCR，得到GDNFcDNA， GDNFcDNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序鉴定后，纯化回收，限制性内 切酶Hind Ill、Kpn I双酶切pAdTrack-CMV(9220bp)及GDNFcDNA， 酶切产物纯化后，在T4 DNA连接酶的作用下，将GDNFcDNA定向插入 于pAdTrack-CMV的Hind llI、Kpn I酶切位点之间，纯化回收连接产物。 3．用氯化钙制备感受态大肠杆菌DH5 a，将连接产物转入感受态大肠杆菌 DH5 Q后，接种在含有卡那霉素的阳性培养基中大量扩增。取一部分扩增 的大肠杆菌DH5 d提取质粒，以提取的质粒为模板，GDNF的特异性上、 下游引物做PCR鉴定，并将质粒DNA做限制性内切酶Hind III、Kpn I双 酶切鉴定；另一部分扩增的大肠杆菌送交测序中心做测序分析。结果：1．提 取的新生大鼠纹状体总RNA经甲醛琼脂糖凝胶电泳可见18s RNA及28s RNA的清晰条带，且28s RNA条带的亮度是18s RNA的两倍；紫外分光 光度法测定A260／A280为1．9。总RNA未明显降解。2．以提取的总RNA 光度法测定A260／A280为1．9。总RNA未明显降解。2．以提取的总RNA 为模板，GDNF的特异性上、下游引物做RT-PCR后，琼脂糖凝胶电泳得 约650bp的片段，测序分析结果显示为GDNFcDNA片段。3．成功制备感 受态大肠杆菌DH5Ⅱ后，限制性内切酶Hind III、Kpn I双酶切 pAdTraek．CMV及，GDNFcDNA，T4 DNA连接酶连接酶切产物，将连接产 物转入大肠杆菌DH5 Q，接种到含有卡那霉素的固体培养基中培养，生长 良好，见大量菌斑。4．将于卡那霉素阳性培养基中培养的大肠杆菌DH5 Q提取质粒，以提取的质粒为模板，GDNF的特异性上、下游引物做PCR 扩增后，琼脂糖凝胶电泳得约650bp的片段。限制性内切酶Hin棚I、Xpn I酶切提取的质粒后，琼脂糖凝胶电泳得约650bp的片段和9200bp的片段。 测序分析结果显示GDNFcDNA插入方向正确，核苷酸序列与GenBank中 大鼠GDNFeDNA序列相同，共插入载体pAdTrack-CMV中653bp的基因 片段。结论；本实验构建的pAdTrack-CMV-GDNFeDNA真核表达载体， 经PCR、酶切鉴定和测序分析证明为目的GDNFcDNA片段，核苷酸序列 与GenBank中大鼠GDNFcDNA序列相同，且连接方向正确。载体构建成 功。 关键词：胶质细胞源性神经营养因子；大鼠；基因重组；载体 CONSTRUCTION CONSTRUCTION AND IDENTmCATIoN OF THE RECOMBINANT ADENOVIRAL VECToR CARRYING RAT GLIAL CELL UNE-DERIvED NEURoTRoPmC FACToR GENE Abstact：0bjective：To construct the recombinant adenoviral vector by gene recombination technology for the preparation Of gene therapy of cerebral ischemia，obtain eDNA fragment of the rat glial cell line—derived neurotrophic factor(GDNF)by RT-PCR，then clone GDNFcDNA into pAdTrack-CMV． Methods：1．The eDNA sequence of GDNF was retrieved from America NLM internet nucleic acid database；the primer of GDNF was designe