结直肠癌不同临床分期蛋白质动态表达规律及预后分子分型模式研究-内科学专业论文.docxVIP

本人声明，所呈交 本人声明，所呈交 工作及取得的研究成果。 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说 明。 弘∥耖 日期：丝年{月三日 作者签名： 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位 论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论 文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。 作者签名： 锄加 导师签名磷日期：坠上月兰日 本国家973计划 本 国家973计划 国家自然科学 湖南省自然科 中南大学优博扶植项目(NO．2009ybfzlO) 湖南省教育厅研究生创新基金项目(NO．C 博士学位论文1研究背景及目的 博士学位论文 1研究背景及目的 人类肿瘤的启动、发生与进展是一个涉及到多基因、多步骤、多 因素的复杂过程。结直肠癌(Colorectal cancer CRC)是常见消化道恶 性肿瘤，其发病率逐年上升。目前采用高通量技术的“组学”研究已 广泛应用于肿瘤的机制探讨及分子表达谱的构建。建立在各种差异表 达谱上的肿瘤分子分型研究已经广泛开展，这为肿瘤的个体化治疗提 供基础。为探讨结直肠癌的发病机制，揭示差异蛋白质分子的动态表 达趋势并构建分子分型模式，本研究采用先进的蛋白质组学技术构建 不同临床分期CRC蛋白质差异表达谱，绘制差异蛋白质的动态表达 曲线图；通过对差异分子的预后分析，筛选并建立CRC预后相关的 分子分型，使CRC从常规诊断进入到分子诊断水平，为实现CRC的 个体化治疗提供理论依据。 2材料和方法 收集不同临床分期CRC标本及病理资料，建立CRC标本库。取 不同临床分期CRC组织样本20例进行荧光差异双向电泳 (Two—dimensional differential in gel electrophoresis，2D-DIGE)，其中临 床TNM I～Ⅳ期CRC组织标本各5例，I期癌旁远端自身正常对 照标本5例，采用DeCyder全自动分析及统计系统进行差异分析，构 建不同临床分期CRC蛋白质差异表达谱。 1．)利用EDA模块对差异蛋白质动态表达趋势图进行聚类分析及 主成分分析，采用Cluster 3．0软件进行非监聚类分析，探索蛋白质表 达变化规律。同时与采用相同标本进行基因和转录组学研究的其它课 题组结果进行差异分子表达水平的组学对接研究。 2)通过MALDI．TOF．MS质谱分析鉴定差异蛋白质，并对其功能、 细胞定位及相互作用网络等进行生物信息学分析。最后通过Western blotsSH免疫组化实验验证差异蛋白质的表达情况。 3)对103结直肠癌组织芯片标本进行随访，获得生存资料。利用 Kaplan．Meier生存分析方法对临床病理资料进行预后研究；通过判别 分析与生存分析相结合的方法建立不同临床分期的判别函数，构建不 同的CRC预后分子分型模式，同时评估预后分子分型模式的准确率、 博士学位论文 博士学位论文 中文摘要 灵敏度以及特异性。 3结果 1)通过对不同临床分期25个结直肠蛋白质样品进行2D．DIGE实 验，扫描后获得高质量的荧光凝胶图谱。DeCydel-分析发现4863匹 配的蛋白质点，对不同临床分期CRC及正常组蛋白质进行的两两 t-test检测(pO．05；Av．Ratio≥2)得到任意两组之间的蛋白质差异 表达数目，其中I期与正常组之间差异表达蛋白质点较多，而II期与 正常组之间差异较小。5组间采用单因素方差分析(one．way-ANOVA： P0．05)得到199个差异表达蛋白质点(每组≥3／5患者有表达)。其 中在肿瘤中表达上调的67个分子、表达下调的114、在不同临床分 期中的表达可高于或低于正常组织的有18个分子。 2)通过对199个差异蛋白质点的模式聚类分析得到4种Kmean’S 聚类结果和8种Som聚类结果。模式聚类结果很好的展示了差异蛋 白质点在不同发病阶段的动态变化趋势，揭示了蛋白质动态变化规 律。主成分分析和非监聚类分析发现晚期(III与Ⅳ期)CRC患者 之间不能形成阶段特异性聚类。通过与其它课题组在基因、蛋白质、 转录水平的表达对接研究后得到表达改变基本一致的3个分子CAl、 CA2、ANXA4。 3)通过质谱鉴定了40个差异蛋白质分子，其中上调lO