结节性硬化症新靶向治疗的探索和肿瘤免疫治疗融合蛋白的制备-生物化学与分子生物专业论文.docxVIP

独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在指导教师指导下进行的研 究工作及所取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医 科大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 堡查 签字日期：丛生年上月』壁日 万方数据 附件5：关于学位论文使用授权的说明 附件5： 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大 连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于(请在以下相应方框内打“4”)： 1．保密口，在一年解密后适用本授权书。 2．不保密口。 作者签名： 刁为 日期：H占年如f3 Et I 导师签名： 砍衣议侈 日期： 年 月 日 万方数据 大连医科大学目 大连医科大学 目 录 第一部分结节性硬化症新靶向治疗的探索 一、摘要 l (一)中文摘要 1 (二)英文摘要 2 二、正文 3 (一)前言 3 (二)材料和方法 ．6 1．材料 6 1．1 细胞系 6 1．2抗体和试剂 ．．6 1．3仪器和材料 ．．7 2．方法 8 (三)结果 12 1．谷氨酰胺酶抑制剂降低mTOR活 化细胞的增值 12 2．3-BrPA和BPTES对Tscl神经元 敲除小鼠无显著疗效 14 3．LiCI和Li2C03减弱mTOR活化细胞 的增值能力 ．1 6 4．构建GFAP．Cre，TSClloxp／10xp小鼠 1 8 万方数据 大连医科大学(四)结论 大连医科大学 (四)结论 20 (五)讨论 20 (六)参考文献 22 第二部分肿瘤免疫治疗融合蛋白的制备 一、摘要 24 (一)中文摘要 24 (二)英文摘要 25 二、正文 26 ＼—LL—L (一)日U舌 26 (二)材料和方法 30 1．材料 30 1．1菌种和载体 ．．30 1．2抗体和试剂 ．．30 2．方法 33 2．1基因克隆的基本实验 33 2．2抗体纯化相关实验 40 (三)结果 42 1．LAG3．PDl．Fc及PDl．LAG3．Fc的结构 ．．42 2．重组质粒结构的鉴定 43 3．融合蛋白的表达及鉴定 45 (四)结论 47 万方数据 大连医科大学(五)讨论 大连医科大学 (五)讨论 47 (六)参考文献 49 三、综述 51 (一)综述 5l (二)参考文献 55 四、攻读学位期间发表文章情况 57 五、致谢 58 万方数据 大连医科大学结节性硬化症新靶向治疗的探索 大连医科大学 结节性硬化症新靶向治疗的探索 中文摘要 结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex，TSC)是一常染色体显性遗传 多系统良性肿瘤综合症，TSCI或TSC2突变引起mTOR过度活化，导致患者发生癫 痫、发育迟缓、智力受损和自闭症，癫痫大发作，颅内高压，肾脏肿瘤破裂出血、 肾功能衰竭，呼吸衰竭，可危及病人生命。因为受众相对较少，与其它罕见病一样， 人们对结节性硬化症缺乏重视，药物鲜有开发，虽然mTOR抑制剂雷帕霉素 (rapamycin)及其衍生物是TSC的靶向治疗药物，但由于雷帕霉素只是抑制细胞 增长而不是杀死细胞，停药后肿瘤会恢复生长。因此，需要寻找更好的治疗方法， 是目前亟待解决的问题。由于mTOR活化可引起有氧糖酵解、谷氨酸依赖等代谢异 常，为了探索结节性硬化症(TSC)的新疗法，我们使用糖酵解抑制剂(3一溴丙酮 酸，3-BrPA)、谷氨酰胺酶抑制剂(BPTES)、GSK3 13抑制剂(Licl、Li。CO。)处理正 常细胞系(WT)和mTOR活化的细胞系(TSC2一／一、Pten一／一)，发现3-BrPA、BPTES、 Licl及Li：cO。都能有效抑制mTOR活化的细胞系(TSC2一／一、Pten一／一)的增殖。由 于全身性Tscl或Tsc2缺失小鼠均是胚胎致死，我们建立了生后21天死亡的TSCl 神经元(Synapsin—cre，TSClh廿。1“9)和50天死亡的神经星形胶质细胞(GFAP—cre， TSCl¨胛。1“9)特异性敲除的两种小鼠模型，3-BrPA、BPTES未能改善Synapsin—cre， TSCIh一’1“9小鼠的生存期，以上3类抑制剂将用于治疗6FAP—cre，TSClh冲几“9小鼠。 关键词 结节性硬化症谷氨酰胺 GSK3 13 BPTES 氯化铝