分子克隆工具酶限制和修饰课件.pptVIP

以上迁改数量均为施工图评审确定的数量，项目具体内容详见相关设计图纸。乙方需按批准施工图完成各杆线线路及设施安装、征地及青苗补偿、验收资料等工作。 分子克隆工具酶 ——限制和修饰(restriction and modifying ) 周口师范学院生命科学系 进行基因工程操作，首先要获得需要重组和能够重组的DNA片段。（如何获得？） 用相应的酶进行切割，就可以获得含有完整基因片段、复制起始位点、转录启动子或转录区等具有特定功能的DNA片段。 那么，如何将需要的DNA片段切割和连接呢？ 1 限制酶的发现 20世纪30年代初发现噬菌体在不同菌株之间的限制现象与不受限制现象， 60年代提出对上述现象解释的假设: 内切酶能识别并切断外源DNA的某些位点使其失活而限制外来噬菌体的繁殖，属限制酶类 。 E.coli菌株 λ噬菌体感染率 λ（K） λ（B） λ（C） K 1 10-4 10-4 B 10-4 1 10-4 C 1 1 1 λ噬菌体不同感染株对E.coli不同菌株的感染率 说明： K菌株和B菌株中有一种限制系统，可以排除外来的DNA。 C菌株不能限制来自K菌株和B菌株的DNA。 这种限制作用就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。 限制酶的功能： 降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中。 修饰酶的功能： 对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身的DNA不被降解。 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。 核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片断。 核酸外切酶：从核酸分子的末端开始逐个地切割降解核苷酸。 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease）： 一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。 2 限制酶的分类: 根据其识别和切割序列的特性，催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 三类。 广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 1968年，从E．Coli K株发现限制 酶能降解非同源DNA，但切口少， 不 能产生专一性切口，归类为I类限制酶。 1970年，从流感噬血杆菌中分离到一种限制酶，对DNA的 切割有一定的切口，要求特异的识别序列，很快被用于DNA结构与功 能研宄，是II类限制酶 ． ? 特性 I型酶 II型酶 III型酶 限制和修饰 ? 双功能酶 内切酶与甲基化酶分离 双能酶 识别位点 非对称序列 回文对称结构 非对称序列 切割位点 在距识别位点至1000bp处随机切割 识别位点上 距识别位点 24 – 26 bp处 序列特异性切割 否 是 是 分子克隆中应用 无 广泛 很少 3 限制酶的命名原则 第一个字母，大写，来源宿主属名的第一个字母； 第二、三个字母，小写，取自种名的头2个字母； 第四个字母，大写，取自它来源菌株系；最后用罗马数字大写，代表同一菌株中不同限制酶的编号。 前3个字母斜体 例： E.coR I E 为大肠杆菌的属名(escherichia)的第一个字母 co. 种名(coli)的头两个字母 R 表示所用大肠杆菌的菌株 I 表示该细菌中分离出来的这一类酶的编号 E．Coli Rye l3株分离到EcoRI, EcoRII，EcoRV 4 限制酶识别序列 限制酶在dsDNA上能够识别的特殊核苷酸序列。 E. coR I GAATTC Hin d III AAGCTT Sau 3A GATC Dra II PuGGNCCPy Pu 代表A或G Py 代表T或C N代表任意碱基 偶数核苷酸组成的识别序列，以中线为轴，两侧核苷酸互补对称。 E. coR I GAATTC CTTAAG 奇数核苷酸组成的识别序列，以 N N