抗病毒及抗膜补体调节蛋白双特异性抗体的制备及效应研究-免疫学专业毕业论文.docx

抗病毒及抗膜补体调节蛋白双特异性抗体 抗病毒及抗膜补体调节蛋白双特异性抗体 的制备及效应研究 摘 要 f 、、／补体系统在机体的抗病毒免疫中处于一线防御地位，是病毒建立感染 所止颟面对和克服的机体的第一道防线。作为机体重要的天然免疫防御系 统及特异性体液免疫应答的重要效应系统，补体系统除了具有溶解、清除 病毒等致病微生物，阻止病毒进入靶细胞，调理病毒的吞噬等重要功能外， 还可通过“识别”自身组织细胞表面的补体活化调节蛋白来对自身细胞加 以保护，使之不受侵害。遗憾的是，一些有包膜的病毒也在长期的演化过 程中获得了补体系统的这种自我保护机制，即可以通过结合宿主膜补体调 节蛋白来逃避补体的攻击。病毒免疫逃避的机制也可能是我们寻求有效的 抗病毒治疗的靶点。因此我们设想，1)是否可以通过封闭病毒表面补体活 化调节蛋白的功能来消除病毒逃避补体攻击的机制，恢复病毒对补体攻击 的敏感性?2)由于膜补体调节蛋白在体内广泛表达，是否可以通过制备针 对病毒及其表面补体活化调节蛋白的双特异性抗体来实现特异性封闭病毒 表面的补体调节蛋白。同时利用抗体的Fc段诱导内源性补体活化，提高补 体抗病毒的效率的目的? 为了验证我们的设想，本研究进行了下面三部分的实验。 1．以严重危害人类健康，且具有复杂免疫逃避机制的有包膜的HIV病 毒及痘苗病毒的EEV病毒为研究对象，首先对它们逃避补体攻击的现象进 行了验证，探讨了宿主膜补体调节蛋白CD55、CD59与HIV病毒及EEV 病毒免疫逃避的关系，评价了病毒结合的这两种补体调节蛋白作为本研究 提出的，通过消除病毒逃避补体攻击的机制来恢复病毒对补体攻击的敏感 性，提高补体抗病毒效率这一抗病毒策略的靶点的可能性。 为此，本研究分别以人T细胞系MT4细胞及人上皮细胞Hela细胞为宿 主细胞，制备收集了HIV一11113病毒及EEV病毒。然后分别用用流式细胞 术及Western Blot技术检测了补体调节蛋白CD55、CD59在病毒宿主细胞 及病毒(EEV)表面的表达、结合情况。结果表明：CD55、CD59均高表达 及病毒(EEV)表面的表达、结合情况。结果表明：CD55、CD59均高表达 于MT4细胞及Hela细胞；Western Blot检测发现CD55、CD59存在于EEV 病毒上。将这两种病毒分别暴露于人血清补体后，发现在有CD55、CD59 中和性抗体存在的情况下，补体溶解HIV病毒的效率明显增加；EEV病毒 的感染活性在空斑实验中也明显降低，结果与这两种蛋白在病毒表面(EEVl 存在的事实相符，提示病毒表面的CD55、CD59介导了病毒对补体攻击的 抵抗作用。CD55、CD59的中和性抗体能够发挥消除病毒的补体攻击逃避 机制，恢复病毒对补体的敏感性的实验结果提示，这两种补体调节蛋白可 以作为以消除病毒逃避补体攻击的机制、恢复病毒对补体攻击的敏感性， 提高补体抗病毒效率为目标的抗病毒策略的靶点。 2．在明确病毒表面的补体调节蛋白可以作为消除病毒逃避补体攻击的 机制，提高补体抗病毒效率这一策略的靶点的基础上，为了实现靶向封闭 病毒表面的补体调节蛋白，同时利用抗体的Fc段诱导内源性补体活化，提 高补体抗病毒的效率的目的，本研究又以痘苗病毒的EEV病毒为研究对 象，制备了针对EEV病毒及其结合的，对该病毒逃避补体攻击有关键作用 的补体调节蛋白CD55的双特异性抗体，通过体外空斑实验观察了用这种 策略制各的双特异性抗体在消除病毒逃避补体攻击的机制、诱导补体活化、 增强补体抗病毒效率中的作用，并将其抗病毒活性与亲本抗体进行了比较。 为此，我们首先制备、纯化了兔抗EEV病毒抗体及小鼠抗人CD55的 抗体。然后参考相应文献，用化学交联的方法将两种抗体交联，制备四价、 双抗原结合活性的异二聚体形式的双特异性抗体(Heteropolymers，HP)。并 用凝胶过滤层析的方法对其进行了纯化。双特异性抗体制备后首要的问题 是如何鉴定其抗原结合活性，本研究根据文献报道，用ELISA的方法对我 们制备的双特异性抗体的单特异性及双特异性进行了鉴定。间接ELISA实 验结果显示我们制备的双特异性抗体具有良好的EEV病毒及CD55结合活 性；交叉检测结果显示，双特异性抗体具有完整的结构，从而提示具有良 好的两种抗原结合特异性。最后，病毒中和功能实验结果显示，我们制备 的双特异性抗体具有良好的诱导补体活化，中和EEV病毒感染的作用，与 亲本抗体相比有增强的EEV病毒中和活性。结果提示用这种策略制各的双 特异性抗体能够发挥消除病毒逃避补体攻击的机制，恢复病毒对补体的敏 特异性抗体能够发挥消除病毒逃避补体攻击的机制，恢复病毒对补体的敏 感性，同时诱导补体活化，提高补体抗病毒效应的作用。实验结果初步证 实了我们的设想的可行性，从而为HIV病