课件：基因诊断和基因治疗演示课件.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是双链DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 腺病毒的优点 基因导入效率高，对人类安全； 宿主范围广； 基因转导与细胞分裂无关； 重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； 腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。 腺病毒载体缺点 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 靶向性差。 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。 （3）腺病毒相关病毒载体 单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 AAV Virus Particles AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。 AAV载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段； 感染效率比反转录病毒载体低, 在40%-80%的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。 常用基因治疗载体 ? 整合 致病性 感染细胞 克隆容量 反转录病毒 载体 随机整合，效率高 可能致病 分裂细胞 7kb 腺病毒载体 不整合，可能丢失 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 ? 腺相关病毒载体 定点整合(19号染色体特定区域) 不致病 分裂细胞、非分裂细胞 5kb 7.5kb 2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 脂质体介导的基因转移示意图 （2）受体介导转移技术 将DNA通过多聚阳离子与细胞配体偶联，多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。 受体介导转移技术示意图 （3）基因直接注射技术 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。 基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因干预 （gene interference） （一）反义RNA（antisense RNA） （二）干扰RNA RNAi （三）核酶技术 四、基因治疗的应用研究 （一）遗传病的基因治疗研究 (一)遗传病基因治疗必须符合以下要求 1.在DNA水平明确其发病原因及机制； 2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传； 3.该基因的表达不需要精确调控； 4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用； 5.该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述4条以上要求的不过