不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增殖、分化的影响.docxVIP

不同糖浓度对体外培养小鼠成纤维细胞增 殖、分化的影响 Abstract： Objective To find the relationship betouse fibroblast ount of the out cell type I collagen fibers ouse type I collagen Elisa kit,and the expression of a smooth muscle actin （a SMA） tested by immunochemistry.Results A,positive correlation ouse a SMA.Conclusion At the original augmentation of the blood glucose,the proliferation of fibroblast is not different. But fibroblast to myofibroblast,and the concentration of glucose is positively correlated ooth muscle actin, a SMA）被普遍认为是肌成纤维细胞表型的可 靠证据。本实验利用小鼠成纤维细胞培养，在体外模拟高血糖的环 境，设定不同糖浓度，研究不同时间下成纤维细胞生长增殖情况和 胶原合成情况，从而为了解不同糖浓度下成纤维细胞增殖情况奠定 体外试验基础。 材料与方法 1主要试剂 胎牛血清高糖DMEM 培养基（购自Gibico） , Cell Counting Kit 8试剂盒（购自碧云天试剂公司），羊抗小鼠I型胶原抗体，羊 抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa）,兔抗羊二抗（购自 Santa）小鼠I型胶原ELISA试剂盒（购自Sygma）。 2实验方法 2.1成纤维细胞的原代培养 取健康试验用家鼠（昆明小鼠）， 处死后将背部皮肤毛发刮去，酒精消毒，取3cmX3cm大小皮肤， 用无菌剪刀剪去皮下脂肪组织，将皮肤剪碎后散落在无菌培养川L 中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，培养1周左 右，带成纤维细胞迁出组织块后，剔去大块组织，继续培养，并传 代多次后纯化等到成纤维细胞。 2.2不同浓度糖培养液的制备普通高糖DMEM培养基葡萄糖 含量为25mmol/L （每升培养基含葡萄糖4500mg）,加入一定量左 旋葡萄糖后过滤，配置成糖浓度梯度为25、40、55、70、85mmol/L 的培养液，其渗透压按照分别为5311、5603、5896 6181 6474mmHg,在正常值5311 ~6227mmHg范围内或稍高。依次为 A、B、C、D、E 5个糖浓度组，按照普通组即A组相当于正常血糖 值餐后高值7mmol/L,即各组相当于血糖值的7.0、11.2、15.4、 19.6、23.8mmol/Lo 2.3成纤维细胞的鉴定和I型胶原的组织学观察采用爬片法， 使成纤维细胞在特制放滑玻片上生长，待细胞生长到约占70%时， 取出玻片，采用细胞免疫组化法（一抗为羊抗鼠I型胶原单克隆抗 体，二抗为兔抗羊单克隆抗体）染色（购自Santa）。 2.4成纤维细胞增殖的CCK测定使用CCK 8试剂盒检测 （购自碧云天试剂公司）。将细胞消化后加入到96孔板中，每孔加入 100 P1 2000个细胞，过夜，待细胞贴壁生长后用A、B、C、D、E 5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，每孔加入10111 CCK 8溶液，在细胞培养箱内继续孵育0.5?4小吋，在450nm 测定吸光度（其细胞数量和吸光度成正比）。 2.5成纤维细胞I型胶原的Elisa测定 将细胞消化下后，按照细 胞数1X104个/孔接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用 A、 B、C、D、E 5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小 时，然后用移液管反复吹打孔底，吸上清，用鼠I型胶原Elisa试剂 盒测定细胞外胶原的浓度。 2.6成纤维细胞肌动蛋口的Western blot将细胞消化下后， 按照同样的浓度接种到48孔板中，过夜，待细胞贴壁生长后用A、 B、 C、D、E 5个浓度的培养液培养，时间为12、24、48小时，吸 去上清后将培养皿放置在冰上，假如蛋口提取液提取细胞蛋口质， 测定蛋白浓度，经过煮沸、制胶、蛋白上样，冰上电泳后转膜，封 闭，加入一抗小鼠肌动蛋白单克隆抗体（购自Santa）和二抗兔抗羊 二抗（购自Santa）后，孵育，洗膜，曝光，检测肌动蛋口。 3统计分析 实验数据以土s表示，组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA）o 结果 1成纤维细胞的鉴定和I型胶原的组织学观察 如图1为未加入一抗的对照组，不仅细胞未被染色，而且细胞 间未观察到有被染色的I型