临床常见深部真菌的实验室检测进展.docxVIP

临床常见深部真菌的实验室检测进展 王国荣 (山东省沂南县人民医院检验科 山东省沂南县 276300) 【摘 要】木文以临床常见深部真菌念珠菌、侵袭性曲霉菌、隐球菌和组织胞浆 菌为对象，就近年来非培养检测方法的研究进展作一综述。阐述了真菌胞壁或胞 内成分烯醇化酶、beta-葡聚糖、甘露聚糖和Cand-Tec抗原等抗原检测的方法 和方法学评价；阐述了 pcr、分子杂交等分子生物学方法对这些真菌的各种特异 性靶基因的检测，比较各种方法的特异性和敏感性；简述了真菌代谢产物的研究 现状。 【关键词】医学检验真菌检测 近年来，随着抗牛素、免疫抑制剂及皮质类固醇激素在临床上广泛应用, 器官移植、导管插管等普遍开展，深部真菌感染率越来越高。引起深部真菌感染 的病原菌主要有白色念珠苗、曲菌和隐球菌等。传统的检测方法主要为血培养和 组织活检，但血培养耗时长，阳性率较低，组织活检缺乏典型改变，影响早期及 正确诊断。近年来，用于检测真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查和特异 性基因片段的分子牛物学检测已成为这一领域研究的热点。 1真菌胞壁或胞内成分的检测 1.1.烯醇化酶(Enolase)烯醇化酶乂称2—磷酸一lgt;甘油盐水解酶或 弹力酶，是糖酵解所必需的胞内酶。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞中，含量丰富 且高度保守。它也是白色念珠菌中含量最为丰富的蛋白质之一，研究显示只有在 深部白色念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄牛在浅表部位的白色念殊菌一 般不会释放该酶。Walsh等采用白色念珠菌烯醇化酶单克隆抗体检测血标木中的 白色念珠菌烯醇化酶以确定是否有深部真菌感染，并以组织活检和血培养加以对 照。在组织活检或血培养中阳性的24例肿瘤患者中，抗原阳性18例,146例组织 活检或血培养阴性的肿瘤患者中，抗原阳性6例。敏感性和特异性分别为75%和 96%[1]O由于烯醇化酶在体内具有很强的抗原性，形成免疫复合物在体内迅速清 除，使检测敏感率受到影响。有学者建议检测血清中抗烯醇化酶抗体及抗体滴度 的动态变化来诊断深部念珠菌病?但因寄殖者也可检测到抗体，免疫缺陷者常缺 乏抗体，故抗体检测仅有补充诊断价值。 2分子生物学方法 深部真菌的血清免疫学鉴定方法尽管有了很人发展，但仍存在耗吋长、 敏感性低的问题。近年来，研究者了大量工作，试图应用分子生物学方法鉴定医学 重要真菌弥补传统方法的不足。作为分子生物学方法，必须具备以下几个条件: A、选择最适当的靶基因，满足商用试剂盒的检测。B、适当提取真菌DNA的方 法。C、最适合常规实验室开展。 2.1样本处理：DNA样本的制备对真菌检测至关重要。一份理想的样本 应为不含蛋白质残渣、污染物、DNA抑制剂，并具有较高的浓度。虽然目前已有 多种真菌DNA提取和纯化试剂盒问世，但没有一种能被普遍采用的最佳产品。 另外，标本的来源也与检测结果有关。一项研究显示，血培养阴性的侵袭性念珠 菌感染的血清较全血标本的PCR检出率高（27%vs7%）。 2.2靶基因的选择：深部真菌的靶基因包括单拷贝、多拷贝细胞核基因 和线粒体基因及RNA。一般而言，多拷贝基因的检测灵敏度高于单拷贝基因。多 拷贝线粒体基因已广泛用于白色念珠菌和各种曲霉菌的PCR检测。核糖体基因包 括存在于所有真菌的高度保守序列如18S、28SrDNA或rRNA和高度可变的内部 转录间隔区（ITS）,前者可用于筛选真菌感染，后者则用于菌种的确定。各种真菌 的靶基因见表2。 2.3 Southern杂交在PCR扩增的片段中设计种特异性探针,用同位素或生 物素进行标记，与事先转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的PCR产物杂交，可鉴定到 种,其敏感性比电泳提高一个数量级。由于Southern杂交存在操作繁琐、耗吋长 等缺点，此方法更适用于研究，而不宜作为实验室检测真菌的常规方法。 2.4特异性寡核昔酸探针斑点（狭缝）杂交斑点（狭缝）杂交可分为正向杂交 和反向杂交。前者是将PCR产物固定到膜上然后用放射性或非放射性标记的探 针与膜上的PCR产物杂交,最后通过一定的检测手段得到杂交信号。而后者则是 将探针经加尾后固定于膜上，将已标记的PCR产物与膜上的探针进行杂交。因为 反向杂交可将多种探针同吋固定于同一张膜上,这样可以一次检测多种真菌，省吋 省力，具有很好的应用前景。 Posteraro等设计一对通用引物扩增ERG11基因,针对此基因中的靶序列设计10 种寡核背酸探针，通过一个点杂交装备将加尾后的探针点在膜上，经固定后与标记 有生物素的PCR产物杂交，可将10种临床常见真菌直接鉴定到种水平 2.5 PCR-ELISA微孔板杂交法近年来,ELISA利用酶促反应催化底物显色用 于检测PCR扩增产物。微孔板杂交与膜杂交相比有以下优点:①易操作;②漂洗吋 间短，节省时间;③本底低,也不需要封闭过