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噬菌体展示技术和中药活性成分靶点蛋白筛选探究 ［摘要］噬菌体展示技术是将所需多肽/蛋白从大 量变异体的集落中提取出来的一种高通量的体外筛选技术， 因其髙效、实用、便捷的优势现已广泛应用于药物研发的多 方面领域，在中药活性成分靶点蛋白中也有越来越广泛的应 用。靶点蛋白是药物分子在体内的结合位点，良好的靶点是 获得优良药物的基础。该文综述了噬菌体展示技术的研究进 展及其在中药活性分子靶点蛋白筛选中的应用。 ［关键词］噬菌体展示技术；中药活性成分；靶点蛋白; 筛选 噬菌体展示技术(phage display technology)是近年 来备受瞩目的一种快速筛选药物分子靶点蛋白的应用技术， 最早建立于1985年，很快就因其简便的操作、可控的过程、 可靠的结果及其强大的筛选功能在药物研究各领域得到了 充分发展和广泛应用［1-5］,尤其是为发现小分子物质在体 内结合的靶点蛋白提供了新颖便捷的工具，同样为中药活性 分子的作用机制研究提供了新的思路和方法。 本文拟就噬菌体展示技术的方法原理及在中药活性成 分靶点蛋白筛选方面的应用做一综述。 1噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种能够将所需性质的多肽/蛋白从 含有大量变异体的集落中提取出来的体外筛选技术[6],其 原理是以丝状噬菌体为载体，将外源基因片段克隆至噬菌体 外壳蛋白基因中，并以融合蛋白的形式表达于噬菌体外壳， 从而实现了基因型与表型的统一，大量的这样表达有外源片 段（基因或蛋白质）的噬菌体就组成了噬菌体展示文库。噬 菌体展示文库提供了大量的结构与功能信息，同时实现了高 通量和高效率筛选的可能性。噬菌体展示技术最大的特点就 是实现了基因型和表型的直接联系[7],这种联系使得噬菌 体展示文库可以经过相对简单易行的筛选操作后进行测序， 以鉴定所筛选到的克隆，并可以通过再扩增进行更多轮的筛 选，研究者可以在基因分子克隆的基础上准确地实现蛋白质 构象的体外控制，获得具有良好生物学活性的表达产物。可 以研究大分子的酶、受体、抗体、其他结构或功能蛋白，也 可以研究小分子的化合物，甚至可以研究完整细胞或器官的 结合蛋白。 噬菌体展示技术最初由美国密苏里大学Smith等于1985 年建立，当时他们将外源基因片段与噬菌体fd-tet的基因 III（g3）连接，发现该外源基因片段编码的多肽可以与噬菌 体基因的编码蛋白以融合的形式展现在噬菌体的表面。后来 有人经实验证实，噬菌体颗粒本身的黏附、侵入及整合功能 不会因外源性DNA片段的插入而受到影响，同时外源片段在 噬菌体外壳的表达也保持了其原有的三维空间构像。此后， 噬菌体展示技术由于其简便、有效、易于控制的特点及基因 型与表型统一的优势使其逐步得到推广，应用日趋广泛和深 入，反过来，这种应用领域的不断拓展也使得噬菌体展示在 技术层面得到更多缜密的修订和补充，发展得日臻成熟［8］。 目前，噬菌体展示技术在抗原表位分析［9-10］.分子相互 作用［11］、单克隆抗体的制备［12］、药物筛选［13］、疫苗研 制［14］、疾病发病机制研究［15］及功能基因组学［16］等多个 研究领域均得到了充分发挥，而且这种应用仍在不断的探索 和拓宽之中，如最近有人利用噬菌体展示技术开发出商品化 的测序技术平台，用于靶向药物的开发和疾病诊断［17-18］； 有人将噬菌体展示技术与纳米递质系统相偶联，制备成单分 散乳剂以促进大分子药物透过血脑屏障，提高生物利用度 ［19］ o 噬菌体展示技术的筛选原理又称生物淘洗，是利用分子 与相应配体间的特异性亲和力进行的［20］。其大致过程可表 示见图1,首先将待研究的目标分子固定化，加入噬菌体文 库令其充分相互作用进行结合选择，在此过程中，含有目标 分子特异性结合配体的噬菌体克隆结合到固定化的分子上， 未结合的噬菌体克隆被直接洗去，然后用缓冲液或游离分子 将结合的噬菌体克隆洗脱下来，收集洗脱的噬菌体克隆感染 宿主细胞进行扩增，获得的噬菌体进入下一轮筛选。如是经 过吸附-洗脱-扩增”循环式的3?5轮筛选，最终洗脱的 噬菌体克隆经初步结合试验鉴定后，分别挑取单个克隆进行 序列分析，根据测序结果分析其共有的保守片段，该序列对 应的基本氨基酸序列即为测试目标的靶点蛋白序列。 经过噬菌体展示库筛选得到的只是“可能”的靶点蛋 白，仍然需要根据目标分子的不同类型进行进一步的验证。 如常使用ELISA检测该蛋白序列与目标分子的特异性结合情 况，通过包被目标分子与富集噬菌体中的单克隆相互作用， 利用酶标二抗的显色反应检查该单克隆噬菌体是否结合了 目标分子。另外，根据目标分子及靶点蛋白所具有的或可能 具有的生物学功能合理设计实验，从而进行结构功能的验证 也是必不可少的[21] o 2药物靶点的发现及中药活性成分靶点蛋白研究 在药物及其活性成分所引发的一系列连