04 实验4 叶绿体色素的提取、分离及含量测定.pptVIP

实验4 叶绿体色素的提取、分离、理化性质及含量测定 实验目的 掌握叶绿素提取、分离的原理 加强对叶绿素部分理化性质的认识 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和叶绿素b的方法及计算 实验原理 提取原理 分离原理 叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化反应，产生的盐能溶于水，而类胡萝卜素是脂溶性的，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。 测定原理 测定原理 在红光区，叶绿素a、b的最大吸收峰分别在663nm、645nm，吸收曲线彼此有重叠。根据Lambert-Beer定律，如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，并通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。 测定原理 根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，换算后得公式： Ca=12.7A663-2.69A645（1） Cb=22.9A645-4.68A663（2） CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645（3） 可计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的浓度（μg/mL） 。 理化性质 (1)叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光； 理化性质 (3)叶绿素中的镁可被氢离子取代而生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐后，去镁叶绿素则成为绿色的铜代叶绿素，后者很稳定，在光下不易破坏，故用此法制作绿色植物的浸制标本 器材与试剂 实验器材：分光光度计、电子天平、研钵、容量瓶、三角瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管、移液管、分液漏斗、试管 实验试剂：丙酮、石英砂、碳酸钙粉、盐酸、醋酸—醋酸铜溶液（6g醋酸铜溶于100mL 50％的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成），30% KOH—甲醇溶液（30g KOH溶于100mL甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中）、乙醚 实验材料：菠菜叶片 实验步骤 1. 叶绿体色素的提取 2. 叶绿体色素的理化性质观察 3. 叶绿素和类胡萝卜素的分离 4. 叶绿素含量的测定 1. 叶绿体色素的提取 取菠菜叶2g左右于研钵中，加石英砂、碳酸钙粉少许，加少量丙酮研磨成匀浆，用丙酮定容至25mL，混匀，过滤于三角瓶中，即得叶绿体色素提取液。 2. 叶绿体色素的理化性质观察 （1）光对叶绿素的破坏作用 2支装叶绿素过滤液的试管，分别放在直射光下和暗处，1h后对比观察颜色有何变化，解释原因。 2. 叶绿体色素的理化性质观察 （2）铜代反应 方案1：取1支试管，加入叶绿素过滤液1mL，逐滴滴加浓盐酸溶液，当溶液变褐后，再滴加醋酸—醋酸铜溶液，观察记载溶液颜色变化情况（可微微加热）。记录现象并解释颜色变化原因。 方案2：取1支试管，加入叶绿素过滤液3mL，逐滴滴加浓盐酸溶液，当溶液变褐后，再添加少量醋酸铜晶体，观察记载溶液颜色变化情况（可微微加热）。记录现象并解释颜色变化原因。 2. 叶绿体色素的理化性质观察 （3）叶绿素的荧光现象观察。 取叶绿素过滤液4—5mL加入试管中，观察直射光下其反射光和透射光的颜色差别，记录实验现象，解释原因。 3. 叶绿素和类胡萝卜素的分离 取叶绿素过滤液5mL，加入盛有10mL乙醚的分液漏斗中，摇动分液漏斗，沿漏斗边缘加入15mL dH2O, 轻轻混匀(勿激烈摇荡)， 分层后，弃去下层丙酮和水，用蒸馏水冲洗1-2次，弃去下层水溶液，再加入3.5mL30% KOH—甲醇溶液，用力摇动分液漏斗，静置10min，再加dH2O 10mL，摇动后，静置分层即可。 ◆下层是皂化的叶绿素a和b；上层是乙醚溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。 4. 叶绿素含量的测定 对照：80%丙酮作空白对照 测定：取叶绿素过滤液1mL，加丙酮至10mL，混匀，分别在663nm和645nm下测定吸光度值，记录结果。 计算： Ca=12.7A663-2.69A645 Cb=22.9A645-4.68A663 CT=Ca+Cb=8.02A663+20.21A645 注意事项 1. 提取液注意避光 2. 色素分离不理想时，可调整乙醚及KOH—甲醇溶 液的用量。 3. 取代反应观察时，盐酸及醋酸铜溶液要逐滴加入。 作业 1. 记录叶绿素理化性质及分离的实验结果，并分析原因。 2. 按公式计算出叶绿素a、b、T的浓度，及叶绿素总的百分含量。 另取醋酸—醋酸铜溶液20mL，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片2片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。 * 叶绿素 类胡萝卜素 叶绿素a，兰绿色 叶绿素b，黄绿色 胡萝卜素(α、β、γ)，橙黄色 叶绿体色素 叶黄素， 黄色 这两类色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 C32H30ON4