6.4色谱法病理生理学.pdf

高效液相色谱法和气相色谱法 一、概述 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC) ，系采用高压输液泵将 规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品由流动相 带入色谱柱，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统 记录色谱信号。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等特点，是在药 品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。按色谱分离机制，高效液相色谱法可以分为吸 附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法与分子排阻色谱法等；按固定相的物态，可以分为 液-固色谱法(LSC)和液-液色谱法(LLC) 。 二、高效液相色谱仪 1．高压输液泵 用于输送流动相。要求流量恒定且可以自由调节，耐高压，耐腐蚀， 适于梯度洗脱等。 2 ．色谱柱 用于组分的分离。色谱柱系由柱管和固定相组成，采用匀浆法高压装柱。 按规格可分为分析型和制备型两种，常量分析型柱内径 2～5mm，长 10～30cm，半微量分 析型柱内径1.0～1.5mm，长10～20cm 。 3 ．进样阀 用于将供试品溶液注入色谱柱。目前使用的均为六通进样阀，使用六通进 样阀可以在不中断流路、带压情况下直接进样，还可配不同容积的样品环(简称定量环) ，可 按需要更换。进样阀的进样量准确、重复性好。 4 ．检测器 是将流动相中组分浓度变化转变成电信号变化的装置。检测器要求灵敏度 高、噪音低、线性范围宽、重复性好。最常用的检测器是紫外检测器，其他常见的检测器有 光二极管阵列检测器、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和 质谱检测器等。 高效液相色谱仪示意图 三、分离原理 分配色谱法的分离原理系利用被分离组分溶入互不相溶的固定相和流动相，并达到平衡 后的浓度之比(分配系数) 的差别而被分离。 按照固定相和流动相极性的相对大小，分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配 1 色谱法。 1．正相分配色谱法 系指流动相极性小于固定相极性的分配色谱法，简称为正相色谱 法。在正相色谱法中，极性小的组分由于 K 值较小，所以先流出，极性大的组分后流出。 正相色谱法用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。 2 ．反相分配色谱法 系指流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，简称为反相色谱 法。在反相色谱法中，极性强的组分因 K 值较小而先流出色谱柱，极性弱的组分后流出。 反相色谱法是应用最广泛的高效液相色谱法，主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型 物质。 最常用的固定相是化学键合相(简称为键合相) ，系通过化学反应将固定相的官能团键合 在固体载体表面而成。目前，常用的化学键合相按其极性可分为非极性键合相和极性键合相。 非极性键合相常用的有十八烷基硅烷键合硅胶(Octadecylsilane，ODS 或C18)和辛基硅烷键合 硅胶(C )等，适用于反相色谱法。其中，ODS 是反相色谱法中最为常用的固定相。极性键合 8 相 常用氨基和氰基硅烷键合相，既可以用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。 四、色谱系统适用性试验 色谱系统适用性试验系指用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。如达不到 要求，可对色谱分离条件作适当的调整。色谱系统适用性试验通常包括：理论板数、分离度、 重复性和拖尾因子等四个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的 参数。 (一)色谱柱的理论板数(n 在选定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图， 量出供试品主要成分峰或内标物质峰的保留时间 t ( 以分钟或长度计，下同，但应取相同单 R 位)和半高峰宽(W ) ，按下式计算色谱柱的理论板数： h/2 2 n=5.54(t / W )