【分子诊断学】_3核酸与蛋白质的分离与纯化.pptx

;2015年1月20日，美国总统奥巴马在国情演讲中启动精准医疗计划。精准医疗是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。;课程要求;本章课程内容;核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。包括DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）。而基因是控制生物遗传结构和功能的基本单位，是有遗传效应的DNA片段。 蛋白质是生物功能的执行者，具有生物催化、物质运输、防 御、调控等多种生理功能。 得到高??纯化，同时具有生物活性的目标物质是研究核酸和蛋白质的 关键问题。;1;1;;;1;;;分离纯化步骤越多，核酸纯度高但得率低；分离纯化步骤越简化，得率高纯度低。;（1）核酸的浓缩;沉淀的特点 1.易将核酸溶液调至所需浓度 2.改变溶解核酸的缓冲液种类 3.去除部分杂质与某些盐离子;(DNA样品含有盐，会使A260偏高，此时需测A310 以扣除背景，并以A260与A310差值作为定量计算的依据）;原理： 荧光染料溴化乙锭（EB），可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。;（1）紫外分光光度法 A260 /A280 的比值来判定有无蛋白质污染和鉴定核酸纯度的重要指标。 纯的DNA A260与A280之比应在1.8 纯的RNA A260与A280之比应在2.0 ;核酸凝胶电泳法：以溴化乙锭为示踪剂，结果可判定核酸制品的完整性。;;2;2;;大于150kb的DNA分子多数易被切断;;;;真核细胞基因组DNA分离纯化主要方法有：酚抽取法，甲酰胺解聚法， 玻璃棒缠绕法，各种快速方法等。;本法最初于1976年由Stafford及其同事创立;基因组DNA的分离与纯化;基因组DNA的分离与纯化;;方法：破碎细胞方法同酚抽提法，用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA结合，再透析获得DNA，分子量一般大于200kb;包括细菌、支原体、衣原体、立克次体、 放线菌和蓝绿藻等,是最简单的细胞生物体。 病原微生物引起感染性疾病 感染性疾病诊断复杂;;;;得完整DNA,首先要纯化病毒粒子： 1.SDS或酚处理或两者结合处理 2.避免剧烈振荡及搅拌防止DNA切断，使用宽口吸管吸取DNA溶液;2;;;;;;;;;;;2;;;;;3;3;;3;;1总RNA提取法中最常使用的方法。 2.以异丙醇沉淀RNA，可选择性地沉淀大分子rRNA和mRNA，故提取的总RNA中rRNA和mRNA比例高，小分子量RNA较少;特点 ：简便、经济和高效，RNA提取质量高，且高完整性与纯度。;以（异）硫氰酸胍-酚为裂解液，再加入氯仿形成两相，变性的DNA与蛋白质位于两相之间，上层RNA溶液，最后异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤。;3;Poly(A+)：绝大多数mRNA在其3‘末端带有一个长短不一的poly(A)尾巴 起始材料：总RNA样品;;;;原理：不用填柱;原理 利用oligo(dT)与poly(A)的互补配对特性、生物素与链亲和素的特异性结合和磁性分离。;;4;4;;;;4;;①超声破碎法 ②渗透压法 ③冻融法;5.裂解法 通过使用裂解液使细胞裂解，常用的比较如下表所示;4;目的：将目标蛋白质与细胞中其他物质分离，由固相转入液相， 或从细胞内的生理状态转入到外界特定的溶液中。;（1）水溶液提取分离法;和脂质结合牢固/分子中非极性侧链较多的蛋白质 由于亲水性和较强的亲脂性,可用有机溶剂如乙醇、丙酮、丁醇等;4; 通过蛋白质粗制分离，体积较大的杂质大部分已被除去，在此基础之上，进一步对含有的目标蛋白质样品进行纯化。;了解需要纯化的蛋白质的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质，而选择合适的层析方法、层析介质、加样、洗涤与洗脱条件,一般层析技术选择如下：;;;;;;;4;指除去纯化手段提纯的蛋白质溶液中常常含有的多余的盐离子浓 度的过程。 脱盐的主要方法有三种，即透析法、超滤法、凝胶过滤法。;;真空干燥 ：其原理与减压浓缩相同，真空度愈高，溶液沸点愈低，蒸发愈快。通常适用于不耐高温、易氧化物质的干燥和保存。 ;;从近年核酸和蛋白质前沿研究的发展方向来看，组织、细胞的分离纯化所得的目的物质，有助于从分子水平了解生命活动的规律及揭示生命现象的本质。高纯度的目的物质应用于工业生产、医疗保健、基因因工程等方面，如食品、发酵等的高活性酶制剂、猪胰岛素治疗糖尿病，转基因动、植物等。;;;;;