人维生素K环氧化物还原酶催化维生素K环氧化物的机制研究.pdf

摘要 摘 要 人维生素K 环氧化物还原酶 （hVKOR ）是位于内质网的整合膜蛋白，通过 催化维生素K 循环中的限速步骤，参与维生素K 依赖性蛋白的翻译后修饰。临 床常用抗凝血药华法林通过特异性靶向 hVKOR ，阻断维生素K 循环，使肝脏 合成的凝血因子的 γ-羧基化受抑制而产生抗凝作用。目前，hVKOR 催化维生素 K 环氧化物（KO ）的机制是基于量子化学理论提出的，但是在细胞环境中具体 的催化机制尚不清楚。因此，深入研究生理条件下 hVKOR 催化KO 的催化机 理具有重要的理论意义，也有助于我们理解华法林的抑制机制。 目的：通过构建野生型hVKOR 以及突变体的稳定细胞系，利用凝胶迁移实 验、定量质谱以及分子模拟等方法，捕捉hVKOR 在催化KO 过程中形成的电子 转移中间体，进一步揭示细胞环境下hVKOR 催化 KO 的催化机制。 方法： 1. 以 pcDNA5/FRT 为载体，利用快速克隆的方法构建表达野生型 hVKOR 以及相关半胱氨酸突变体的重组质粒，通过测序验证其是否构建成功。 2. 体外常规培养293T-REx 细胞，将测序成功的重组质粒pcDNA5 / FRT 与 pOG44 以 1：10 的比例共转染293T-REx 细胞。48h 后，向培养基中加入一定浓 度的抗生素（杀稻瘟菌素和潮霉素）筛选稳定的细胞系；通过向培养基中加入强 力霉素，诱导目的蛋白表达。 3. 建立KO 诱导的凝胶迁移实验。将稳定表达野生型hVKOR 以及相关半胱 氨酸突变体的细胞分为 KO 处理组与未处理组，分别进行还原和非还原的 SDS- PAGE 电泳，用 Western Blot 检测 KO 处理对 hVKOR 各突变体电泳迁移的影 响。 4. 从稳定细胞系中纯化表达野生型hVKOR 以及各半胱氨酸突变体的蛋白， 用定量质谱的方法分析每个半胱氨酸的氧化还原态。 5. 结合细菌 ssVKOR 的结构，利用计算机模拟的方法分别构建 hVKOR 与 KO 以及hVKOR 与华法林结合形成的复合物结构模型。 结果： 1. 利用 pcDNA5/FRT 成功构建表达野生型 hVKOR 以及各突变体的重组质 粒。 2. 利用 293T-REx 细胞成功构建稳定表达野生型 hVKOR 以及各突变体的细 胞系。 3. KO 诱导的凝胶迁移实验结果显示，C43A 突变体在加入 KO 处理之后， I 摘要 在非还原的 SDS电泳中出现了一个迁移带，迁移现象在还原的 SDS- PAGE 电泳中消失，而其它突变体并未出现迁移现象。在 C43AC135A 、 C43AC135S 双突变体中，用同样的方法经KO 诱导处理后，进行非还原的 SDS- PAGE 电泳，发现C43A 中KO 诱导的凝胶迁移在这两个双突变体中均消失。 4. 对野生型hVKOR 和各突变体进行定量质谱分析，结果显示C43A 突变体 中的C135 在加入KO 处理后变为氧化态，并且KO 处理还诱导了C43A 突变体 中更多的C16 和C85 处于氧化态；其它突变体的C135 在KO 处理前后氧化还原 态的变化不明显，除 C43A 突变体外，其它突变体中 C16 、C85 、C96 在 KO 处 理前后氧化还原态无明显变化。结合以上结果，我们构建出hVKOR 催化KO 的 催化机制模型。 5. 利用计算机模拟的方法成功构建了hVKOR 与KO 以及hVKOR 与华法林 结合的复合物结构模型，提示KO 与华法林结合同一个口袋，进而我们提出一个 华法林抑制hVKOR 的模型。 结论： 1. 在细胞内 hVKOR 具有两种