细胞培养技术.docVIP

细胞培养技术 细胞培养的基本原理 细胞培养的基本设备与用品 细胞培养用品的清洗与消毒灭菌 清洗 1?常用玻璃器皿清洗 橡胶制品的清洗 G6除菌滤器的清洗 正压除菌滤器的清洗 塑料制品的清洗 清洗液的配制 消毒灭菌 湿热消毒 干热消毒 紫外线消毒 滤过消毒 消毒剂 塑料器皿消毒 电离辐射消毒 细胞培养用液的配制与除菌 蒸憾水的制备 平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）的配制 天然培养基 合成培养基 血清细胞培养基 无血清细胞培养基 7?消化液 pH调整液 200毫摩尔/升L—谷氨酰胺 抗菌素液 细胞用液的分装方法和耍求 …?细胞培养的基本原理 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细 胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留英一定的结构和功 能特性。细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象 不同。细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块（0. 5? 1立方毫米）或薄片（厚0. 2毫米），而器官培养使用的是器官原基或器官的 一部分或整个器官。在组织培养屮，细胞自组织块周围移出并生长，细胞 在生长过程中总有移动（运动）或英它变动，这样就使被培养的组织难以长 期维持其原有的结构和功能。培养时间越长，发生变化的可能性越大，结 果常使单一类型的细胞保存下来，最终成了细胞培养。在细胞培养屮，细 胞生命活动和体内细胞一样，仍然是相互 依存的，呈现一定的组织特异性，所以组织培养和细胞培养实际上无 严格区别。 但细胞培养方法也存在不足Z处：培养细胞失去体内细胞的制约和幣 体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。培养方法、实验 试剂对细胞形态和功能有一定的影响，如胰蛋白酶可破坏细胞表面受体、 酶、抗原等。长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的 影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。 二?细胞培养的基本设备与用品 （1） 细胞培养的基本设备 细胞培养的基本设备有：C02培养箱，倒置显微镜，净化台，压力蒸 汽消毒器，自动双重纯水蒸憾器，液氮罐，冰箱，电热干燥箱，电热恒温 培养箱，电动吸引器，抽气泵等。 （2） 常用的实验用品 玻璃器皿 细胞培养所用的玻璃器皿应由透明度好、无毒的中性硬质玻璃制成。 常用的有以下几种：国产螺旋口培养瓶［有12. 5毫升，25毫升，100毫升 等规格，国外培养瓶常以底面积（平方厘米）表示］;培养皿（直径冇3. 5厘 米，6厘米，9厘米，10厘米等规格）；离心管（5毫升，10毫升）；注射器 （1毫升，5毫升等）；用生理盐水瓶代替的贮存瓶（100毫升，250毫升，500 毫升）；青霉素瓶（5毫升）；西力辛瓶（10毫升）；其它还有尖吸管和移液管， 载玻片（厚度 0. 8-1. 2毫米），盖玻片（厚度0. 12毫米），贮存尖吸筒用的玻璃筒 或金属筒，漏斗，烧杯，量筒，贮蒸憾水瓶，冷冻管（1?5毫升，2毫升） 等。 塑料品 多孔培养板规格有4、6、12、24、96孔等，培养1111直径有3厘米、6 厘米、10厘米等。塑料品经消毒灭菌密封包装，供一次性使用，重复使用 的需经特殊方法清洗消毒。犁料器材厚薄均匀，有的表面经特殊处理，细 胞易于生长。 器械 解剖刀、眼科剪和银（直头和弯头）、中号圆头锡、止血钳等。 杂用品 金属饭盒、试管架、各种规格胶塞、记号笔、塘瓷盘、吸头（吸取液体 的胶帽）、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶、火柴等。 组织培养中使用最多的是吸管、培养瓶、培养皿及各种瓶塞。实验者 手中应有三套器材，瓶塞数要大于瓶数，才能保证实验中的循环使用。 三?细胞培养用品的清洗与消毒灭菌 （1）清洗 常用玻璃器皿清洗 ?清洗耍领 浸泡 初次使用的玻璃器皿呈碱性，表面常附有灰尘和一些对细胞有毒的物 质，如铝和碑等。空气湿度高时，玻璃器皿表面又易长霉。使用前，新器 皿浸泡在5%稀盐酸中过夜，以中和玻璃表面的碱性物质并去除霉斑；然 后经简单刷洗，流水冲洗（逐片进行），蒸憾水浸泡，干燥备用。新玻片处 理后，短时间不用时，需将它投入95%的酒精中保存，以防玻片长霉。培 养后的玻璃器皿应立即投入清水中浸泡，器皿屮残留的细胞、蛋白质一旦 干涸，即固着于玻璃表面，极难脱落。 刷洗 用过的玻璃器材经自来水冲洗后，浸入水屮煮沸，然后将适量洗涤剂 （洗洁精或洗衣粉）投入沸水中继续煮沸10分钟，趁热刷洗器皿内外，刷洗 后浸入清水中进行冲洗。 酸泡 刷洗好的玻璃器材干燥后置清洁液中浸泡24小吋,清洁液的强氧化 作用可清除刷洗不掉的极微量杂质。 O清洗步骤 玻璃器材煮沸10分钟一刷洗一流水振荡冲洗15?20遍一50°C烤干一清 洁液浸泡24小时一流水振荡后冲洗15-20遍?漓水?蒸幅水浸泡2次（每 次24小吋）-*50°C烤干，待包装。 O清洗