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分子克隆常用技术 一、 核酸的纯化 在分子克隆的所有操作屮，最基木的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋 白质，通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每肖需要把克隆有某一 些所用的酶灭活或去除以便进行下一步吋，可进行这种抽提。然而，如要从细胞 裂解液等复杂的分子混合物小纯化核酸，则要先用某些蛋口水解酶消化大部分蛋 白质后，再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等， 它们对多种天然蛋白均有活性，(1)用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比 单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品屮的痕量 酚。①核酸样詁置有盖小离心管屮，加入等体积的酚/氯仿。②旋涡混匀管内容 物,使呈乳状。③12000Xg室温离心15秒。④水相移入另一离心管，弃去两相 界面和有机相。⑤重复步骤①一④步操作，直至两和界面上见不到蛋白质为止⑦ 按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。 二、 核酸的浓缩 应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在屮等浓度单价阳离子存在下，加入 一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA 或RXA,也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液屮。 具体操作吋，可向含样品的小离心管屮加入V/1O单价阳离子盐贮存液2V 无水乙醇，混匀，放冰水浴P 15 —30min,取出R］测平衡，0—4度，12000g,离 心lOmino吸弃JL清，再另70%乙醇0.5 —lml, 12000g, 0—4度洗涤离心2min。 吸弃上清，沉淀用油泵抽干或打开盖子晾干后，溶于适半体积的缓冲液屮。 单价阳离子盐溶液 贮存液(mol/L) 终浓度(mol/L) (醋酸钱* 7.5 2.0-2. 5 LiCl 8.0 0.8 NaCl 2.0 0.2 醋酸钠 3.0 (pH5. 2) 0.3 *：当加醋酸鞍时，需加入DNA液的V/2。 单价阳离子盐的选择，主要基于下述考虑：用醋酸较可减少dNTP的共沉淀，但 在以后要作核酸的磷酸化时应避免用醋酸鞍，因鞍离子是T,多核昔酸激酶的强 烈抑制剂。半用较高浓度的乙醇沉淀R\A时，常用LiCl,因LiCl在乙醇屮溶解 度很高，不随核酸共沉淀。含有SDS的核酸样品，应使m NaCl,这时该去垢剂 要70%乙醇屮仍保持可溶。DNA和R\A沉淀，大多使用酷酸钠（pH5.2 ）。 三、DNA、RNA的定量 准确的方法是紫外分光光度法。但本法要求核酸样品是纯净的（即无显著的 蛋白质、酚、琼脂糖或其它核酸、核苜酸等污染物的制品）。用紫外分光光度计 测定260nm和280nm两个波长处的光吸收，然后，按IA260相当于50临/ml 双链DNA。40 u g/ml单链DNA或RNA及20 M g/ml单链寡核昔酸。计算你的样品 含量。260nm和280nm两处读数的比值（A260/A280）,可反映核酸的纯度。DNA 和RNA纯品的A260/A280的值分别为1?8和2. 0如果样品屮有蛋白质或酚的污染, 则A260/A280将明显低于此值，此吋就无法对样品屮的核酸进行精确定量。可将 样品纯化后再作定量测定。有丰富实验室经验的人，仅凭样品电泳后渙化乙锭染 色萤光带的强度，即可人致判断出样品屮的核酸含量，故他们常不作核酸的紫外 分光光度法定量。 、核酸的凝胶电泳和分子量参照物 （-）琼脂糖凝胶电泳 可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其它方法 不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的萤光染料（0.5u g/ml混 化乙锭）染色，在紫外灯下直接观察检测少至Ing的DNA。 DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：?DNA分子的大小：线奖双链DNA 分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物 质和待测分子量的DM片段同时屯泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分 子大小。②琼脂糖浓度：给定大小的DMA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂 扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛，大小不同的DNA片段 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范I韦I 浓度v% (w/v) 分离线状DNA分子的有关范围（Kb） 0.3 5-60| 0.6 1-20 0.7 0. 8-10 0.9 0.5-7 | 1.2 0.46 | 1.5 0? 2 -3 | 2.0 0. 1-2 ③DMA构型：相同分子量的闭环（1型），开环（II型）和线状（III型）DNA, 以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率I型＞111型＞11型。④应用的电压： 在低电压吋，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是压增高吋，大分子 量DXA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压增大 而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超