生物化学实验实验八、九 组织核酸含量化学测定.ppt

商务部《出口鳗鱼技术指南》项目 水产饲料企业高级管理干部培训班 Xiamen University 厦门 翔安 2016年04月07日 实验八、九 组织核酸含量化学测定 Xiamen University 生物化学实验 2016年04月07日 厦门 1868年瑞士科学家米歇尔(F.Miescher)发现细胞核内含高量磷的酸性物质，命名为核素(后改名为核酸) 早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能； 核酸的发现 F.Miescher 核酸作为遗传物质的发现过程 20世纪初，德国生理学家柯塞尔(Kossel)证实了核酸是由四种不同的碱基所组成；美国科学家列文(Levene)又确定了核酸有两种,即DNA和RNA； 1928英国科学家格里菲斯 (Griffith)利用细菌的性状转变实验，证明了遗传信息的可传递性； 1944美国科学家艾佛瑞(Avery )证实了DNA造成细菌性状转变的物质基础； 1952美国科学家赫雪(Heishey)和蔡斯(Chase )证明遗传物质是DNA非蛋白质； 1953年，英国科学家沃森和克里克发现了DNA的双螺旋结构； 核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用 核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖(核糖或脱氧核糖)和磷酸的混合物 核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸 核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定 核酸 nucleic acid 核苷酸 nucleotide 核苷 nucleoside 磷酸 phosphate 嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base (碱基 base) 核糖 ribose 或 脱氧核糖 deoxyribose (戊糖 amyl sugar) DNA和RNA的分子结构 每个核苷酸都含有一个磷酸根，因此可通过测定磷含量来推算核酸的含量。 通常DNA含磷量约为9.84%，RNA含磷量约为9.5%，根据所测磷量可计算DNA和RNA的含量。 组成核酸的戊糖有两种。DNA所含的糖为 β-D-2-脱氧核糖；RNA所含的糖则为β-D-核糖。 Ribose Deoxyribose 核酸的化学性质 核酸可被碱水解 产物核苷酸和脱氧核苷酸 核苷酸可进一步被浓硫酸水解 产物：碱基、核糖和磷酸 核酸定量测定常见的方法 1. 定磷法：将核酸消化，测定其无机磷量，由此计算出核酸含量，反应灵敏。 2. 紫外吸收法：利用核酸在260nm处有吸收高峰，操作简便，受蛋白质和核苷酸的干扰影响。 3. 地衣酚(苔黑酚)法：用于测定RNA的含量，RNA与浓盐酸共热，降解形成的核糖转变为糠醛，利用地衣酚(3,5二羟甲苯)反应来测定，特异性差，戊糖均有此反应。 4. 二苯胺法：DNA中的脱氧核糖在酸性溶液中转化为ω-羟-γ-酮基戊醛，利用二苯胺试剂反应，除脱氧木糖和阿拉伯糖外其他糖类无此反应。 定磷法的原理 首先将核酸样品用硫酸消化成无机磷，利用定磷试剂测定无机磷量。反应式为： (NH4)MoO4+H2SO4 H2MoO4+(NH4) 2SO4 H3PO4+12H2MoO4 H3P(Mo3O10) 4+12H2O H3P(Mo3O10) 4 Mo2O3 ? MoO3(钼蓝) Vit ? C 实验通过测定组织中的含磷量来计算组织核酸的含量。 组织破碎后，经酸(常用三氯醋酸或过氯酸)和脂溶剂的提取，得到不溶于酸的非脂性磷化合物(AINLP).其主要成分为RNA磷(RNA-P)、DNA磷(DNA-P)、磷蛋白、磷和少量其他磷化合物。 采用Schmidt-Thannhauser法 ，使AINLP 降解出RNA和DNA的核苷酸。此法对植物组织不太适用，因为部分DNA为碱所裂解。 上述分离的DNA和RNA降解物(核苷酸或多核苷酸)，去其无机磷化合物，再经强酸消化分解游离的碱醛，戊糖和磷酸，磷酸根PO43-在酸性溶液中能与钼酸铵反应生成戊磷钼酸铵，遇还原剂即变成“钼蓝”蓝色物质，其反应式如下： H3PO