园林植物组织培养 (6).pdf

第三节 园艺植物基因工程常用载体 质粒载体 λ噬菌体载体 柯斯质粒载体 人工染色体载体 载体(vector)的作用  把外源DNA片段带进宿主细胞 ，并使之建立稳定的遗传状态 （繁殖或表达）、且能自我复制的DNA分子  理想载体应具备条件  自主复制 有外源DNA插入时亦可  具备可供选择的遗传标记 易把转化、未转化细胞区别开  有克隆位点 合适位置上供外源DNA插入（限制性内切酶切点 ）  容纳较大外源DNA 本身应尽量小  分子特征清楚 核甘酸序列，基因和酶切位点准确位置  分类 根据功能分类  克隆载体 （cloning vector） ：目的基因克隆 ，建立DNA和cDNA文 库，其上有复制子即可  表达载体 （expression vector） ：能使目的基因在宿主细胞中表达 的一类载体。有复制子，强启动子  穿梭载体 （shuttle vector） ：可在原核细胞复制，也可在真核细胞 中扩增和表达 根据工作方式分类  质粒载体（plasmid vector）  噬菌体载体（phage vector）  柯斯质粒载体（cosmid vector）  人工染色体载体 一、质粒载体 1.1 质粒基本特性 染色体外遗传因子，能 自我复制 ，但依赖于宿主编码的酶/蛋白质 多为双链闭环DNA分子，少数为线性 1kb ～200kb 表型: 抗生素抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物产生毒素（如大 肠杆菌素，肠毒素），固氮、杀虫等 A. 质粒DNA构型 共价闭合环状DNA （cccDNA- covalently closed circular DNA)： 两条核苷酸链均保持完整的环形结构时，呈超螺旋 （SC） （super coil） 开环DNA （open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口 线形DNA （ linear ，l DNA） 质粒空间构型与电泳速率 同一质粒不同构型电泳迁移率： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢 OC L SC B. 质粒的复制 遗传物质传给后代首要条件: 至少具一个复制起始区(ori, origin of replication ，复制起 点) ，使整个基因体得以复制 含有ori的整个遗传物质称为一个复制子 （replicon ） C. 拷贝数 生长在标准条件下，每个细菌细胞所含有质粒DNA分子数 根据宿主细胞所含拷贝数，质粒可分成： 严谨型：低拷贝数质粒，每细胞仅1-3拷贝 (stringent plasmid) 松驰型：高拷贝数质粒 ，每细胞几十-几百拷贝 (relaxed plasmid) 其DNA复制受本身遗传结构控制，不受宿主细胞制约 1.2 标记基因 选择标记：用于鉴别 目标DNA （载体）的存在，将成功转 化了质粒的宿主挑选出来 载体有抗性基因-宿主有抗性-生长 筛选标记：用于筛选重组和非重组质粒 重组——特定基因失活 ——显色异常-白色？ A.选择标记 1) 氨苄青霉素抗性基因 AmpR ampr ampicillin  不带有抗菌素抗性基因 的受体菌不能在含有 抗菌素的培养基（选择 培养基）中生长  带有抗菌素抗性基因的 载体进入受体菌后，受 选择培养基 体菌才能生长 2) 四环素抗性基因 tetr tetracycline 3) 氯霉素抗性基因 chloramphenicol, Cmr