骨髓活检组织前脱钙法与后脱钙法的体会.docxVIP

骨髓活检组织前脱钙法与后脱钙法的体会 鉴于骨髓组织含有大量的钙盐而非常坚硬致密，不能直接进行石蜡制片。需经过脱钙处理后，才能进行切片、HE染色、特殊染色和免疫组化染色1 材料与方法1.1 试剂及仪器4%中性甲醛固定液、浓盐酸、二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、蒸馏水、石蜡、VENTANA HE600染色液、立式全密封脱水机(日本樱花)、组织包埋机(Thermo)、切片机(Thermo)、摊片烤片机(TKY-TKB)、自动染片机(VENTANA HE 600 System)、免疫组化染色机(Lab Vision Autostainer 720)。1.2 脱钙液的配置4%盐酸甲醛溶液:浓盐酸4 ml，甲醛10ml，溶解于86 ml蒸馏水;5%盐酸溶液:浓盐酸5 ml，溶解于95 ml蒸馏水。1.3 两种脱钙方法(1)前脱钙法处理流程:骨髓活检组织经4%中性甲醛固定液固定6～8 h后用4%盐酸甲醛溶液脱钙2 h后行常规脱水，包埋，切片，常规HE染色;(2)后脱钙法处理流程:骨髓活检组织经4%中性甲醛固定液固定6～8 h后直接行常规脱水，包埋，进行蜡块粗修，再将粗修后的蜡块组织表面浸泡于5%盐酸溶液脱钙2～4 h，切片，常规HE染色。1.4 材料标本均来自福建医科大学附属协和医院病理科，随机选取2016-01—2016-12的经前脱钙法处理的骨髓活检标本40例和2018-01—2018-12经后脱钙法处理的骨髓活检标本40例，比较其HE染色效果;从2015-10—2016-12经前脱钙法处理的骨髓活检标本中诊断为急性淋巴细胞白血病的标本中随机选取40例标本，和从2017-10—2018-12经后脱钙法处理的骨髓活检标本中诊断为急性淋巴细胞白血病的标本中随机选取40例标本，比较其Td T的免疫组化染色效果。1.5 结果判定由两位病理医师采用双盲法对HE染色和免疫组化染色结果进行评判。HE染色质量从形态结构清晰、染色均匀、色泽鲜艳、对比度好四个标准进行评估。评估结果分为优、良、差三个等级。完全符合标准的切片为优，基本符合标准(略有瑕疵)的切片为良，不符合标准的切片为差。1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，数据采用非参数秩和检验，以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1骨髓活检组织前脱钙法的脱钙效果及HE染色(图1,4)与后脱钙法的脱钙效果及HE染色(图2,5)均良好(表1),P0.05，两者差异无统计学意义(表2)。2.2 骨髓活检组织前脱钙法的免疫组化染色效果部分抗体着色不均匀，染色偏弱(图3);骨髓活检组织后脱钙法的免疫组化染色效果:抗体着色均匀，染色强度适中(图6，表1),P0.05，两者差异有统计学意义(表3)。3 讨论骨髓活检组织前脱钙法脱钙时间较短，由于是完整骨髓组织块浸泡的脱钙，若出现过度脱钙的现象，则严重影响后续的染色效果和诊断，且无法补救;同时酸溶液的浸泡可导致部分抗原的破坏引起免疫组化染色结果偏弱。而后脱钙法虽然脱钙时间较长，但浸酸仅为粗修后暴露的表面组织且有石蜡的保护，不易出现过度脱钙现象，即使出现，仍可再次修片后二次脱钙，其切片经免疫组化染色组织中细胞仍会显示着色均匀、效果较好，可能是由于石蜡对抗原的保护作用使酸化作用较弱。经后脱钙法处理的蜡块标本脱钙后并没有经过乙醇清洗，而是将蜡块表面的脱钙液擦干后直接放于湿润的冰块上以备切片，一是湿润的冰块上的少量水分既可以清洗蜡块表面残留的低浓度盐酸，有利于组织切片细胞核苏木精的着色;二是湿润的冰块可以替代乙醇清洗，因为乙醇浓度过高时细胞容易发生皱缩，浓度过低时起不了再固定的作用，细胞容易肿胀。骨髓活检组织后脱钙法制片过程中的注意事项:(1)脱钙液要充足，要完全没过蜡块底部，且要定期及时更换;(2)切片时刀要锋利，不要有缺口，卷刀，否则切片困难，尽量做到一个刀口一个蜡块，效果更好;(3)在整个脱钙过程中切忌使用金属容器和器械，尽量采用玻璃器皿;(4)骨组织切片染色易出现脱片现象，最好用粘附载玻片综上，骨髓活检组织后脱钙法不仅能保证HE染色效果，并能提升亲核抗体免疫组化染色效果，具有更好的可行性。