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鱼类肝脏天然维生素A提取、检测方法的比较及应用研究 维生素A（VA）是人体所必需的脂溶性维生素，具有维持视觉、上皮组织、免疫等正常生理功能的作用，当人体缺乏VA时会导致夜盲病、干眼症、生长迟缓、免疫下降等目前VA提取方法主要有皂化法和直接提取法，皂化法又分为常温皂化及水浴皂化，其中直接提取法比较温和且步骤简单，皂化法步骤繁琐但适用范围广。VA的检测方法有紫外法、荧光法和液相色谱法，紫外和荧光法多有不足，随着技术进步，液相色谱成为目前检测VA的主流方法，液相色谱又分为正相色谱与反相色谱，正相色谱多用于VA异构体的测定，反相色谱常用于VA1材料与方法1.1材料与试剂草鱼、乌鳢、金鲳、点篮子鱼、花鲢、龙胆石斑、罗非、大口黑鲈、龙趸石斑鱼肝来源于湛江霞山水产品批发市场。现杀鱼后将肝脏用冰块运回实验室，去除表面脂肪及结缔组织，用预冷的生理盐水清洗后用厨房纸巾吸干表面水分，匀浆后立即冻存于-80 ℃冰箱。抗坏血酸，无水硫酸钠，氢氧化钾，石油醚，2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）均为分析纯：汕头西陇；无水乙醇：天津科密欧；甲醇及维生素A1.2仪器与设备e2695高效液相色谱仪（配2489紫外检测器）：美国Waters；FA 2004型分析天平：上海舜宇；N-1300旋转蒸发仪：上海爱朗；SHZ-B恒温水浴振荡器：上海迅博；MGS-2200H氮吹仪：上海爱朗；超声波清洗机：昆山超声；Z-16KL离心机：美国Sigma；D-24UV明澈超纯水一体机：德国默克；ZLS-3真空离心浓缩仪：湖南赫西。1.3实验方法1.3.1 VA检测方法的确立反相色谱条件为色谱柱：waters BEH C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇:水=（96：4）；流速：0.8 mL/min，进样量为10 μL。正相色谱条件为色谱柱：phenomenex Luna silica（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为正己烷：异丙醇=（99.7：0.3）；流速：1 mL/min，进样量为10 μL。本研究使用标准品进行检测方法的筛选，标准品的配制如下，将VAVA含量计算公式如下：VAVAVA总含量（μg RAE/100g）=VA—根据标准曲线计算得到的试样中VA的浓度，单位为μg/mL；定容体积，单位为mL；f—换算因子，VA的换算为1；m—试样的称样量，单位为g。0.4是VA1.3.2 VA提取工艺的确定本研究选用龙趸石斑鱼肝进行提取工艺条件的确定，操作时使用棕色瓶及锡箔纸包裹的玻璃瓶，尽量避免光线照射。水浴皂化提取法参照GB5009.82-2016，准确称取2 g均质处理后的龙趸石斑鱼肝脏，置于锥形瓶中，加入20 mL水混匀，加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT作为抗氧化剂，加入30mL无水乙醇，再加入质量分数为50%氢氧化钾溶液作为皂化液，混匀后盖上瓶塞于80℃恒温水浴振荡皂化30 min，皂化后立即用冰水冷却。将皂化液用30 mL水转入250 mL棕色分液漏斗中，加入石油醚振荡萃取5 min，将下层水相移至另一分液漏斗中进行第二次提取，合并醚相并水洗至中性后经3 g无水硫酸钠滤入1 L旋转蒸发瓶中，在旋转蒸发仪上浓缩至近干，用甲醇分次溶解残留物后定容至10 mL，过0.22 μm滤膜后待检测。室温隔夜皂化提取法参考刘波直接提取法参照Nimalaratne1.3.3数据处理对不同提取方法提取的VA含量及不同鱼类肝脏VA含量进行单因素方差分析（One-way ANOVA），若差异显著则采用Duncan氏法进行多重比较，以2结果与分析2.1 VA检测方法的确立VA图1是将VA2.2 VA提取工艺条件的确定VA本身是微量元素且其性质不稳定，易被光、热、氧、酸碱等所破坏2.2.1水浴皂化法提取条件的确定通过碱与油脂发生皂化反应，以去除共存类脂化合物，将结合状态的VA酯转变为游离VA，并使得被油脂包裹的游离VA脱离出来，供以测定。质量分数为50%的氢氧化钾溶液，适合大部分样品的皂化需求由图3可知，在水浴皂化法中，随着质量分数为50%氢氧化钾溶液用量的增加，VA总含量呈现先上升后下降的趋势，在加入量为10 mL时VA总含量达到最大值，此后随着氢氧化钾用量的增多，VA总含量开始下降，这可能是因为加入了过多的碱从而加速了游离VA的氧化破坏。因此研究结果显示在水浴皂化法中加入10 mL氢氧化钾为最佳。2.2.2室温皂化法提取条件的确定由图4可知，在室温皂化法中，随着质量分数为50%氢氧化钾溶液用量的增多，VA总含量呈现平缓上升后下降的趋势，随着加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL氢氧化钾时，VA总含