2021重组人突触融合蛋白4对脂多糖诱导的胰岛β细胞INS-1损伤影响和机制研究（全文）.docxVIP

2021重组人突触融合蛋白4对脂多糖诱导的胰岛B细胞INS-I损伤影响 和机制研究(全文) 摘要 目的 探讨重组人突触融合蛋白4(STX4)对脂多糖(LPS)诱导的胰岛B细胞INS-1 损伤影响。 方法 胰岛β细胞INS-1分成Control组(空白对照)、LPS组(LPS处理)、LPS+NC 组(转染阴性对照载体，LPS处理)、LPS+STX4组(转染pcDNA-STX4 , LPS处理),RT-qPCR和Western blot检测STX4 mRNA和蛋白质表达， 流式细胞术检测凋亡，DCFHDA法检测活性氧簇(RoS)水平、黄瞟岭氧化 法检测超氧化物歧化酶(SoD)水平、比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)水平、铝酸镀比色法检测过氧化氢酶(CAT)水平、硫代巴比妥酸 法检测丙二醛(MDA)水平，ELISA法检测细胞分泌的白细胞介素-邛(IL-I B)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平和葡萄糖条件下胰岛素分泌水平， Western blot 法检测 Cleaved Caspase-3x Bax、p65 蛋白质表达。用 NF-κB信号通路激活剂处理上调STX4后的胰岛B细胞INS-1 ,给予LPS 刺激，同样利用上述方法测定细胞凋亡、ROS、SODs GSH-Pxs CAT、 MDA水平和分泌的IL-邛、TNF-8胰岛素水平以及Cleaved Caspase-3. Bcl-2相关X蛋白(Bax)、p65蛋白质水平。 结果 与Control组比，LPS组胰岛B细胞中STX4 mRNA和蛋白质表达均减少, 细胞凋亡率、ROS水平、MDA水平均升高，SOD、GSH-Pxx CAT水平 均降低，细胞分泌的IL-10、TNF-CC水平均升高，细胞分泌的胰岛素水平 降低，Cleaved Caspase-3x Bax、p65蛋白质表达水平也升高。NF-κB 信号通路激活剂处理逆转上调STX4对LPS条件下胰岛β细胞凋亡、ROS、 SOD、GSH-Pxs CAT、MDA水平和分泌的IL-邛、TNF-α,胰岛素水平 以及Cleaved Caspase-3x Baxs p65蛋白质水平影响。 结论 上调STX4抑制LPS诱导的胰岛β细胞氧化损伤、细胞凋亡和炎症因子释 放，机制与降低NF-κB信号通路激活水平有关。 胰岛B细胞是一种影响机体血糖水平的重要调控细胞，其与糖尿病关系密 切切。糖尿病的发生机制十分复杂，胰岛β细胞功能损伤和机体内的慢性 炎症有关0。脂多糖(IiPoPOIySaCCharideS , LPS)参与影响糖尿病患者体 内的慢性炎症过程，糖尿病患者大便中革兰氏阴性菌的含量大大增加，且 糖尿病患者的血清中LPS高表达，LPS是重要的革兰氏阴性菌细胞膜的组 成部分，也是炎症诱导因子⑶。研究报道显示，LPS刺激以后的胰岛β细 胞释放大量的炎症因子，造成细胞氧化损伤，诱导细胞凋亡发生［4,5］。以 前的研究发现，重组人突触融合蛋白4 (recombinant human syntaxin-4 , STX4)是一个在人体组织中普遍存在的调控基因，与机体生长发育有关，STX4基因定位在1型糖尿病(type 1 diabetes, TID)易感区 IddmW内，其编码的蛋白质是一个TlD候选蛋白质［6］。近些年来，有 研究表明，STX4还可能参与糖尿病发生，STX4在糖尿病发生过程中表达 下调，敲除STX4后的小鼠死于链服佐菌素诱导的葡萄糖不耐受，过表达 STX4能够影响炎症因子刺激的胰岛β细胞中NF-κB活化水平［7,8］。目前 尚未见关于STX4在LPS诱导的胰岛β细胞凋亡、氧化应激和炎症因子分 泌影响的相关研究。本实验以胰岛β细胞INS-I作为实验对象，探讨STX4 对LPS诱导的胰岛B细胞损伤的影响和机制，为分子治疗糖尿病提供参考 思路。 材料和方法 一、材料 谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)检测试剂盒购自 上海励瑞生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-a)检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司;活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒购自美国GeneCopoeia ;过氧化氢酶 (catalase, CAT)检测试剂盒购自上海泽叶生物科技有限公司；STX4抗体 购自美国 Abcam ; Cleaved Caspase-3 抗体购自美国 Proteintech ;白 细胞介素-邛(interleukin-邛/L-邛)检测试剂盒购自上海纪宁酶联科技有 限公司；Bcl-2 相关 X 蛋白(Bd-2 Associated X Protein, BaX)抗体、p65 抗体购自美国Sant