食品免疫学 课件 16 细胞免疫技术.ppt

第十六章 细胞免疫学技术 第一节 免疫细胞的分离与鉴定 第二节 免疫细胞的功能分析 第三节 流式细胞检测技术 Chapter 16 Cellular immunology Technology 第一节 免疫细胞的分离与鉴定 检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。实验动物可取外周血、胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。 方法：密度梯度离心法 介质：葡聚糖-泛影葡胺 一、外周血单个核细胞的分离 红细胞和多核白细胞密度：为1.092左右； 淋巴细胞和单核细胞密度：1.075～1.090， 血小板密度：1.030～1.035。 聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.001 （2）加等量缓冲液 密度梯 度离心 稀释血浆 分离液 红细胞 单个核细胞 粒细胞 (3) 混匀后，缓慢加于分离液上 （1）取血 外周血细胞密度 1. 贴壁黏附法 二、淋巴细胞及其亚群的分离 利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶中，至37℃温箱静置1 h，单核细胞和粒细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。 B细胞也有贴壁现象，采用本法分离到的淋巴细胞群中B细胞会有所损失。 尼龙纤维对B细胞具有黏附能力，利用这个特点进行T、B细胞的分离 该法操作简便、无需特定的设备仪器、成本低廉、可以进行大样本操作。 流程：吸附 洗涤 洗脱 2. 尼龙毛分离法 成熟的T淋巴细胞表面有E受体（CD2），能与绵羊红细胞结合，将淋巴细胞与一定比例的绵阳红细胞混合，绵阳红细胞吸附在T细胞表面形成玫瑰花样细胞团，称为E玫瑰花环。 再经淋巴细胞分离液分离，形成的E玫瑰花环的T细胞位于试管底部，而不形成E玫瑰花环的B淋巴细胞留在分层液界面。 常用于T细胞分离及其数量、活性检测。 3. E花结分离法 4. 免疫吸附分离法 单个核细胞悬液注入玻璃纤维或葡聚糖凝胶层析柱中，有黏附能力的细胞绝大部分被吸附，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。 黏附能力：巨噬细胞或单核细胞树突细胞Ｂ细胞T细胞=红细胞。 常用基质：玻璃珠、尼龙棉、聚苯乙烯和葡聚糖等。 将已知抗细胞表面标记的抗体交联在磁性微珠上，与细胞悬液作用后置于磁场中，借磁力的作用将磁珠结合的细胞分开。 5. 免疫磁珠分离法 一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的技术 流式细胞仪除可进行免疫细胞分离外，还可用于细胞周期、细胞凋亡等细胞功能分析 6. 流式细胞分离法 MHC四聚体（MHC tetramer）是一类免疫学试剂，以带有信号标记的链霉亲合素为基础，交联四个MHC分子单体，形成MHC四聚体。 6. MHC四聚体技术分离法 （一）T细胞功能测定： T细胞增殖试验：淋巴细胞转化试验 观察在有丝分裂原（PHA、Con A）或特异性抗原刺激下T细胞的增殖反应，测定细胞免疫功能。用形态计数法、3H-TdR法、MTT法测T细胞增殖。 第二节 淋巴细胞功能测定 T细胞介导的细胞毒试验：细胞毒实验技术是检测CTL、NK细胞等细胞杀伤靶细胞活性的一种细胞学技术，主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。有LDH释放法、51 Cr（铬）释放法、细胞染色法 、细胞凋亡检测法 磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析检测细胞凋亡 T细胞分泌功能测定： T细胞活化后，能够分泌如IL-2、IFN-γ、TNF-?等具有功能的细胞因子。根据细胞因子不同，可以区分出不同功能的细胞。 常用的方法有酶联免疫吸附法（ELISA）、固相酶联斑点法（ELISPOT）、胞内细胞因子检测法、生物活性检测法和基因水平检测法等。 体内试验：迟发型超敏反应（delayed type hypersensitivity，DTH）是一种免疫细胞体内功能检测的常用方法，又称Ⅳ超敏反应。 将抗原进行皮下注射，就可观察到红斑、硬块的发生和大小。 （二）B细胞功能测定 抗体形成细胞测定试验（溶血空斑试验） B细胞增殖试验 抗体（IgG、IgA、IgM）含量检测 溶血空斑形成细胞试验 1.抗体形成细胞测定试验 不同刺激物能刺激B细胞，进行分裂增殖。 人采用金黄色葡萄球菌蛋白SPA和抗IgM抗体，小鼠B细胞可用细菌脂多糖（LPS）诱导，培养1~3天以后，加3H-TdR，γ射线测定仪检测胞内放射性活性，计算促有丝分裂原对淋巴细胞的刺激指数。也可用台盼蓝法计细胞增殖或用DNA特异性染色观察胞内DNA或RNA的分化程度。 2. B细胞增殖试验 B细胞功能减低或缺陷，可表现为体内Ig和血型抗体量下降或缺陷，机体对外源性抗原的应答能力减弱或缺失，仅产生极低或