果蔬中β-1,3-葡聚糖酶活性测定.pdfVIP

果蔬中β-1,3-葡聚糖酶活性测定 一、目的要求 了解植物体内β-1,3-葡聚糖酶的作用，学习果蔬组织中β-1,3-葡聚糖酶活性的 测定原理和方法。 二、基本原理 葡聚糖是葡萄糖残基以β-1,3-糖苷键连接起来的多聚糖化合物，是绝大多数 真菌细胞壁的主要成分。植物中的葡聚糖酶能以随机作用方式将多聚糖水解成为 糊精或寡聚糖，使真菌细胞壁受到损坏，从而抑制真菌的生长繁殖和对植物的侵 测 染能力，特别是在与几丁质酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长。在正常情 况下，高等植物体中葡聚糖酶表达水平很低，而当植物体被真菌、细菌、病毒侵 检 染或受到机械损伤时，其含量和活性可提高几十倍至上百倍，以增强植物体对不 良外界刺激产生抗性反应。 质 高等植物体内广泛存在着β-1,3-葡聚糖酶 （β-1,3-glucanase ）。β-1,3-葡聚糖酶 能够作用于葡聚糖的β-1,3-糖苷键，产生还原性末端。因此，利用3,5-二硝基水 杨酸 （DNS ）试剂测定生成还原糖的量，可以用来表示β-1,3-葡聚糖酶活性。 液 三、材料、仪器及试剂 （一）材料 测 海 梨、番茄、芒果、香蕉等。 （二）仪器及用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、计时器、移液器、离心管、水浴锅、 上 检 具塞刻度试管 （25 mL ）、容量瓶 （100 mL、1 000 mL ）。 （三）试剂 质 1．100 mmol/L、pH 5.2 醋酸缓冲液 母液A （200 mmol/L 醋酸溶液）：量取11.55 mL 冰醋酸，加蒸馏水稀释至1 000 mL 。 液 母液B （200 mmol/L 醋酸钠溶液）：称取16.4 g 无水醋酸钠 （或称取27.2 g 三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL 。 测 海 取105 mL 母液A 和395 mL 母液B 混合后，调节pH 至5.2 ，稀释至1 000 mL ， 即为100 mmol/L、pH 5.2 醋酸缓冲液。 检 上 2 ．提取缓冲液 称取29 mg EDTA ，0.1 g L-抗坏血酸，吸取35 µL β-巯基乙醇，加入到100 mmol/L 、pH 5.2 醋酸缓冲液中，定容至100 mL ，摇溶，即得提取缓冲液 （含 1 质 mmol/L EDTA 、5 mmol/L β-巯基乙醇和0.1% (w/v) L-抗坏血酸），低温 （4 ℃ ） 贮藏备用。 液 3 ．0.4% 昆布多糖溶液 称取 100 mg 昆布多糖 （Sigma ）加到25 mL 100 mmol/L 、pH 5.2 醋酸缓冲 液中，溶解后低温 （4 ℃ ）贮藏备用。 海 4 ．3,5-二硝基水杨酸 （