污水厂养殖池中好氧反硝化微生物的分离、鉴定及功能筛选.docxVIP

污水厂养殖池中好氧反硝化微生物的分离、鉴定及功能筛选 0 污水反硝化技术 亚硝酸盐是影响水产养殖废水和生活废水的主要有毒物质。较高浓度的亚硝酸盐对动物和人均有致死作用,即使在安全浓度范围内也会对动物体和人体的抗病力及生理功能产生不良影响。水体中,氮以-3至+5九种不同价态形式存在,在生物及非生物因素的共同作用下,各种价态形式的氮在水体内不断迁移转化,形成一个复杂的动态循环 目前污水反硝化处理技术包括物理法、化学法及生物反硝化法。其中,物理、化学法操作复杂,需要增加设备投资额,运行成本高。同时该方法对有机物去除效率低,会造成二次污染,因此在实际运用中存在一定的局限性。近年来,人们开始尝试利用微生物、植物或其他生物自身具有的功能消除或改变污染物存在形态,达到降低污染物毒性的目的 1 材料和方法 1.1 反硝化微生物 2013年8~9月分别从厦门筼簹污水处理厂和前埔污水处理厂初沉池、避风坞海水排污口、海洋三所污水池、漳浦对虾养殖池采集污水和污泥样品进行反硝化微生物的富集。 1.2 培养基的制备 富集培养基:葡萄糖5g,乙酸钠1g,柠檬酸钠2.5g,NaCl 30g,KH 分离培养基:以Marine Agar(MA)和216LB固体培养基(硝酸铵0.2g,乙酸钠1g,柠檬酸钠0.5g,蛋白胨10g,酵母粉2g,NaCl 30g,琼脂粉15g,加超纯水至1L,调pH 7.5,121℃高压蒸汽灭菌20min)作为分离培养基。 1.3 菌株纯化及验证 富集驯化:取10 g污泥/污水样品接种于150mL液体富集培养基中,在28℃、转速为160r·min 菌种分离、纯化:富集培养后,取一定量富集培养液采用梯度稀释平板划线法,在MA或216LB固体培养基上涂板分离纯化单菌。纯化完全后保种并进行反硝化效果验证。每个菌株的编号前面均由两个字母组成,以硝酸盐为唯一氮源分离的菌株编号以X开头,以亚硝酸盐为唯一氮源分离的菌株编号为Y开头。第二个字母代表分离生境,Y、Q、D、P、T1、T2及T3分别代表分离自筼筜污水处理厂、前埔污水处理厂、海洋三所污水池、避风坞排污口和漳浦对虾养殖场的1号、2号及3号养殖池。 1.4 srrna基因扩增 16SrRNA基因测序及系统发育分析:用TIANGEN试剂盒提取单菌基因组DNA,进行16SrRNA基因扩增。16SrRNA基因扩增正向引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(位于E.coli 16SrRNA基因的第8~27个碱基位置);反向引物:5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′(位于E.coli 16SrRNA基因的第1 512~1 493个碱基位置) 1.5 单带反硝化效果的验证 对分离纯化的单菌进行反硝化功能初筛,初筛培养基成分和富集培养基相同,培养基初始的NO 复筛培养基初始的NO 检测分析方法:NO 2 结果与分析 2.1 不同生境来源样品中的单菌 以NaNO 5个不同生境来源的样品微生物组成差异较大,其中,从前埔污水处理厂样品富集分离获得20株单菌,包括盐单胞菌属(7/20)、棒状杆菌属(Corynebacterium,2/20)、芽胞杆菌属(2/20)、海杆菌属(2/20)、海源菌属(1/20)、放线菌属(Aeromicrobium,1/20)、别样海源菌属(1/20)、短杆菌属(Brevibacterium,1/20)、迪茨菌属(Dietzia,1/20)(1/20)、副球菌属(Paracoccus,1/20)和海洋杆菌属(Pelagibacterium,1/20);筼筜污水处理厂样品分离获得18株单菌,包括盐单胞菌属(7/18)、微杆菌属(Microbacterium,2/18)、棒状杆菌属(1/18)、海杆菌属(1/18)、海源菌属(1/18)、别样海源菌属(1/18)、迪茨菌属(1/18)、假单胞菌属(1/18)、嗜冷菌(Psychrobacter,1/18)、Rehaibacterium(1/18)和斯塔普氏菌属(Stappia,1/18);漳浦对虾养殖场的3口养殖池共分离获得64株单菌,主要包括盐单胞菌属(12/64)、芽胞杆菌属(10/64)、假单胞菌属(7/64),其次为海源菌属(4/64)、副球菌属(3/64)、节杆菌属(Arthrobactor,3/64)、微杆菌属(2/64)、Alishewanella(2/64)、红细菌属(Rhodobacter,2/64)、放线菌属(1/64)、壤霉菌属(Agromyces,1/64)(1/64)、别样海源菌(1/64)、Belliella(1/64)、Brachybacterium(1/64)、德沃斯氏菌(Devosia,1/64)(1/64)、Fontibacter(1/64)、喜盐芽胞杆菌(Halobac