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直肠烷基苯磺酸钠对小鼠皮肤组织衰老的影响 苯磺酸钠（las）是目前最常用的阴离子表面活性剂，也是家庭清洁材料中重要的清洁成分。 1 材料和方法 1.1 基因组织及检测试剂 LAS、甲醛、二甲苯、石蜡, 国产试剂均为分析纯, 购自蚌埠医学院试剂公司;D-半乳糖 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司生产) ;超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 、丙二醛 (MDA) 、Masson染液及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒由碧云天生物技术研究所提供。722 s型分光光度计;FA2004电子天平;DY89-I型电动玻璃匀浆机;超低温离心机 (德国Eppendorf公司) ;YL3回转式切片机 (上海仪表厂) ;Synergy 2型酶标仪 (美国Biotek公司) ;全自动高压灭菌器 (日本三菱集团) 。 1.2 国家参数g 5~6周龄昆明种雄性小鼠50只, 体重 (24±1.0) g。购自安徽省实验动物中心, 清洁级动物, 动物批号:scxk (皖) 2011-002。动物饲养温度 (22±2) ℃, 相对湿度65%, 自由饮水进食。 1.3 实验方法 1.3.1 d-半乳液的测定 LAS剂量参考预实验结果及本实验室以往的实验资料 1.3.2 小鼠的体外剥毛 将50只雄性小鼠常规饲养1 w后随机分成5个组, 每组10只, 分别为正常对照组、LAS低、中、高剂量组 (LAS 150、300、600 mg/L) 及衰老模型组。正常对照组及LAS不同剂量组的处理:在每个小鼠的背部剃毛, 面积约1.5 cm×1.5 cm, 每天用蒸馏水及不同剂量的LAS涂抹剃毛处, 连续涂抹60 d。在其过程中, 小鼠毛发生出, 及时剃除。衰老模型组小鼠每日在颈背部皮下注射5%D-半乳糖25 ml/kg, 持续60 d。各组小鼠每周称重1次, 第61天将小鼠脱臼致死, 取涂抹部位皮肤 (衰老模型组小鼠背部剃毛并摘取相应部位皮肤) , 去除皮下脂肪组织, 用4℃生理盐水清洗, 滤纸拭干, 一部分固定用于组织切片, 一部分用于皮肤匀浆, 另外一部分用于测定羟脯氨酸 (Hyp) 含量。 1.3.3 染色、冲洗、封片观察 按试剂盒说明, 将皮肤组织石蜡切片经脱蜡、梯度入水及温热水漂洗后分别用核染液、浆染液、分色液及复染液染色、冲洗、封片后, 置镜下观察。 1.3.4 -半乳糖苷酶染色 按试剂盒说明, 将皮肤组织石蜡切片经脱蜡及水化处理, 加入β-半乳糖苷酶染色固定液, 室温固定20 min, 用PBS液洗涤, 加入染色工作液, 37℃温箱孵育过夜, 普通显微镜下观察。 1.3.5 匀浆、上清液的制备 取部分皮肤组织用剪刀剪碎, 按1 g加9 ml生理盐水制成10%的匀浆, 3 000 r/min将匀浆液离心10 min, 取上清液。按试剂盒要求, 检测小鼠皮肤组织匀浆中MDA含量及SOD、GSH-Px活性。 1.3.6 水解浴水解液 按试剂盒要求, 准确称取小鼠皮肤组织80~100 g, 剪碎, 加6 mol/L HCl 1 ml, 沸水浴水解5 h。水解液调p H值6.0~6.8, 加双蒸水至10 ml, 取4 ml稀释液用活性炭澄清混匀, 离心后取1 ml作为检测用。 1.4 统计方法 2 结果 2.1 皮肤胶原纤维排列的确定 LAS中、高剂量组小鼠与正常对照组小鼠相比较, 其表皮及真皮厚度明显变薄。正常对照组小鼠皮肤中胶原纤维致密、均匀排列, LAS高剂量组和衰老模型组小鼠, 胶原纤维量染色呈浅蓝色, 皮肤浅表部位, 胶原纤维排列杂乱、松散、模糊, 失去束状排列, 胶原纤维量明显减少, 见图1。 2.2 皮肤中-半乳糖苷酶阳性细胞的检测 老化细胞在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下生成蓝色产物, 正常对照组小鼠皮肤中没有检测到β-半乳糖苷酶阳性细胞;LAS低、中剂量组小鼠皮肤中可发现有零星的蓝色颗粒即β-半乳糖苷酶阳性细胞散在分布;LAS高剂量组及衰老模型组小鼠皮肤切片中能检测到较多的阳性细胞, 说明LAS能够促进小鼠皮肤组织的老化进程, 见图2。 2.3 两组mda、gsh-px活性的比较 LAS不同剂量组及衰老模型组MDA含量均明显高于正常对照组, SOD及GSH-Px活性均低于正常对照组 (P0.01) ;且随LAS剂量增加, MDA含量有增加趋势, 而SOD及GSH-Px活性有降低的趋势 (P0.05, P0.01) 。衰老模型组MDA含量高于LAS低剂量组, 低于LAS高剂量组 (P0.05, P0.01) , 与中剂量组之间无统计学意义 (P0.05) ;衰老模型组SOD活性高于LAS中、高剂量组 (P0.01) , 与低剂量组之间无统计学意义 (P0.05) ;衰老