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基于snp标记的大豆种质资源快速鉴定研究 大豆是一个由豆科这一科引起的一级草本植物。大豆起源于中国已得到国际学者普遍认可 作物品种资源种子身份证的构建已从形态标记向高通量分子鉴定技术发展。传统的鉴定方法主要是形态标记、生理标记和生化指标, 随着品种资源数目的增加, 仅仅基于这些特性已经难以对现有品种准确鉴定 迄今为止, 受制于SNP标记自动化筛选及检测成本高等问题, SNP标记在大豆种质资源的鉴定方面鲜有报道, 利用与表型性状相关的功能性SNP鉴定资源, 且最终以条形码的形式表现的研究更未见报道。本研究利用与主要农艺性状密切相关的功能基因SNP标记, 精准鉴定不同生态区的大豆种质, 分析其DNA指纹图谱, 同时结合大豆品种属性, 构建其分子身份证, 以期为大豆遗传研究、分子辅助育种和品种鉴定提供依据。 1 材料和方法 1.1 黄淮地区树种种 北方种质208份, 于2008年至2010年连续3年种植于北方地区3个不同的地点 (黑龙江、吉林、内蒙古) ;黄淮种质245份, 于2008年至2010年连续3年种植于黄淮地区3个不同的地点 (山东、河南、河北) ;南方种质146份, 于2008年至2010年连续3年种植于南方地区3个不同的地点 (湖北、江西、广西) (图1) 。并对其茸毛色、结荚习性、百粒重、熟期、胞囊线虫抗性等表型进行多年多点鉴定。 1.2 基因组dna提取 萌发后取每份大豆种质5个单株的幼叶混样, 使用Fermentas试剂盒提取基因组DNA。其后加2μL稀释20倍的RNase A, 放到37°C培养箱中15min, 去除DNA中的RNA, 于–80°C保存待送样。 1.3 大豆scn抗性相关基因及gluma13g1493g 选用的23个SNP位点中, 3个来自大豆结荚习性相关基因Glyma19g37890;2个来自大豆茸毛色相关基因Glyma06g21920;7个来自大豆熟期相关基因Glyma06g23026, Glyma10g36600, Glyma19g41210和Glyma20g22160;4个来自大豆SCN抗性相关基因Glyma18g02681和Glyma08g11350;6个来自大豆SMV抗性相关基因Glyma02g13600、Glyma02g13380、Glyma13g26000和Glyma14g204500;1个来自大豆百粒重相关基因Glyma13g22850 (表1) 。采用Infmium芯片技术 (Bioyong Technologies Inc.) , 鉴定全基因组或特定SNP位点。 1.4 多样性计算sn 利用Power Maker 3.25软件 1.5 模拟群体筛选 利用14个SNP在599份大豆种质中的等位变异频率, 通过R程序模拟分析 (/) 。共设置8个模拟群体, 群体大小分别为50、100、500、1000、1500、2000、2200和2500。在20个SNP中 (除去3个没有碱基差异的标记:TT14, PRO16, SER46) 随机选取14个SNP对上述8个群体进行鉴别分析, 该过程一共模拟1000次。最后利用每个群体1000次模拟结果的平均值比较分析。 1.6 数据的统计分析 利用Flapjack软件 2 结果与分析 2.1 snp鉴定结果 本研究23个SNP标记共来自于13个基因, 分别与结荚习性、茸毛色、熟期、百粒重、大豆胞囊线虫病与花叶病毒病抗性相关 (表1) , 用这些标记分析599份种质, 每个SNP标记其遗传多样性指数变异范围为0~0.722, 平均值为0.312。在23个SNP标记中, 9个发生颠换, 变异范围为0.50%~36.93%;5个发生缺失, 变异范围为0.67%~99.16%;6个为转换, 变异范围为0.17%~43.79%。绝大多数位点都有2~3种基因型, 只有3个位点仅有一种基因型, 分别是TT14、PRO16和SER46。 利用599份种质的23个SNP鉴定数据分析表明, 精准鉴定种质间的平均遗传相似性系数为0.7923, 以“中豆24”与“茶色豆”遗传差异最大, 为0.0435, 而“Magnolid”与“Nova”遗传差异最小, 为0.9783。根据中国大豆3个生态区划分 (表2) , 北方生态区 (吉林、黑龙江和内蒙古3个省、区) 208个品种间的平均遗传相似系数为0.8295;黄淮海生态区 (包括山东、河南与河北3个省) 245个品种间的平均遗传相似系数为0.7941;南方生态区 (包括湖北、江西和广西3个省、区) 146个品种间的平均遗传相似系数为0.7982。表明品种间遗传差异以北方生态区最小, 南方生态区次之, 黄淮海生态区最大。 2.2 glysnp14的构建 通过对23个SNP位点的等位变异分析, 发现两类特殊的SNP, 一