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基于ssr标记的葡萄种质分子身份证构建 葡萄是葡萄科的一种植物。叶子是一种古老的木制藤本植物。有许多种杆和广泛的分布。据统计,世界上大约有7 000~8 000个葡萄栽培品种 重复序列DNA(repetitive sequences DNA)包括卫星DNA(satellite DNA)、小卫星(minisatellite)和微卫星(micmsatellite,simple sequence repeat,SSR)3类,其中SSR重复度最低,其标记技术的优点是分布均匀、简便快速、稳定性高、重复性好及多态性丰富 1 材料和方法 1.1 材料表面 选用国家果树种质郑州葡萄、桃圃保存的80份葡萄种质为参试材料(表1)。 1.2 提取dna和pcr系统 幼嫩葡萄叶片基因组提取采用CTAB法 1.3 dna片段区分 利用POWERMARKER软件,根据引物的多样性指数以及高低先后顺序,选择引物组合,最终用9对引物进行种质区分,根据每对引物对不同品种扩增片段对应的分子量大小,按从小到大依次编码为1~9,如果条带数超过9条则依次增加A~Z进行编码。0表示该泳道由于基因片段丢失而无带的零等位基因。参考构建桃分子身份证的构建方法,当引物扩增的某一品种等位基因有2个时,按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值 2 结果与分析 2.1 引物扩增等位基因信息分析 分子身份证的目的就是为了更好地体现不同染色体上的信息,所以尽量选择分布在葡萄19条染色体上的SSR引物,用62对SSR引物对随机挑选的20个品种进行多态性扩增,最终确定28条多态性较高和稳定的引物用于本试验中的分子身份证构建。28对引物对供试品种进行扩增,共检测到169个等位基因,引物对品种扩增的等位基因数分布在3~11个,平均为6.0个。图1为引物SCU15VV对部分种质扩增的电泳结果,共有8个等位基因。 28对引物对80份种质扩增的条带数及其多样性指数见表2,其中等位基因数大于平均数的引物有SCU11VV、WMC4H5、UDV-060、VVMD27、Vr ZAG7、VVMD7、Vr ZAG25、Vr ZAG79、Vr ZAG62、UDV-025、Scu15vv、UDV-048、Vr ZAG93、Vr ZAG64、Vr ZAG21、VVS2、VVS4。等位基因数越多,表明引物在资源中的差异越大 2.2 分子身份证编码赋值顺序 28对引物对不同种质扩增的等位基因谱带大小分布范围及赋值标准见表3。为了保证分子身份证上的字符只有1个,本试验采取赋值时依次按照1~9的顺序进行,当值大于9时按字母A~Z的顺序进行赋值。当引物对某一品种扩增的等位基因数大于1个时,则选择等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值。 2.3 供试品种的筛选 根据表3中等位基因的赋值标准和各引物对品种的扩增结果,对80份种质赋值,结果显示,用筛选出的28对引物按照多样性指数由高到低的顺序进行区分,其中前9对引物就可以区分所有的供试品种(表1)。另外,在已构建的80个分子身份证中有15个品种具有至少一个特异等位基因,其中北醇和超红具有3个特异等位基因,特纳拉和信阳毛葡萄具有2个特异等位基因(表1带“*”)。 3 ssr核心引物筛选 本试验在进行引物的筛选时采取了平均分布在葡萄19条染色体上的62对引物,得到多态性高而且稳定的引物28条,引物多样性指数高于平均数和等位基因数多于平均数的引物,在构建分子身份证时的利用价值很高 通过SSR标记技术,利用POWERMARKER软件,根据引物的多样性指数高低先后选择引物组合,最终用9对引物进行种质区分,构建了80份葡萄品种的有效分子身份证。