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基于细胞捕获的两种药物活性成分筛选方法研究 作为一种典型的抗癫痫药物，蘑菇（pedr）作为植物保护植物。紫杉醇的发现使红豆杉属植物开发研究活动广泛关注 如何快速筛选中药宝库中的活性成分，发现潜在的天然候选化合物，是中药新药开发的关键，也是阐明中药药效物质基础及质量控制的关键 本文采用的中空纤维细胞捕获结合高效液相色谱法(HFCF-HPLC)和细胞捕获-分散液相微萃取结合高效液相色谱法(CF-DLLME-HPLC)，是在模拟生物自然吸收的情况下来筛选和捕获中药中的活性成分群。两种筛选方法采用逆向思维方式，HFCF-HPLC方法直接测定与细胞结合的成分为活性成分;CF-DLLME-HPLC方法根据细胞上清液成分的变化间接判断与细胞结合的活性成分。主要的影响条件得到了优化与研究。在HFCF-HPLC中，我们利用电镜对中空纤维细胞的内表面进行表征;通过比较与标准品的保留时间，确定了与细胞结合的化合物的结构。在CF-DLLME-HPLC，考察和优化影响CF-DLLME-HPLC的变量因素。结果表明，HFCF-HPLC和CF-DLLME-HPLC可以简单、快速地进行中药生物活性成分的筛选和分析。两种方法的成功应用为分析中药的生物活性提供新颖、有效和方便的方法，并且可以扩展使用到其他中药活性成分的筛选研究中。 1 材料表面 1.1 仪器和试剂 高效液相色谱设备(日本岛津公司LC-20A系统);低速离心机(上海安亭科学仪器厂);通用水套CO 1.2 药品、试药与药剂 脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、浆果赤霉素、金松双黄酮、云南紫杉烷:美国Sigma公司;红豆杉(Taxus chinensis)药材批号广州市大参林药店昌岗分店。 红豆杉药材样品经过中山大学药学院生药与天然药物化学实验室杨得坡教授鉴定为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属Taxus L．南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei。 2 方法和结果 2.1 cf-dllme-hplc方法 2.1.1 gc/ms色谱条件 将A546细胞在6孔培养板中培养，细胞接种密度5×10 将6.0 ml含有中药提取液的细胞上清放入10ml带盖玻璃的离心管中，利用500μl注射器将含有400μl四氢呋喃(分散剂溶剂)与60μl CHCl 红豆杉提取物色谱条件:Inertsil ODS-SP-C18柱(5μm,250 mm×4.6 mm i.d.Agilent Technologies)，检测波长227 nm，柱温37℃，进样量20μl，流速0.8-1.0 ml/min，流动相:乙腈(A)-水(B)，用0.45μm微孔滤膜过滤。梯度洗脱:0-10 min,85%A;10-50 min,85%-4%A;50-55 min,4%-85%A。 2.1.2 萃取效率的影响因素 本实验考察了萃取剂种类、萃取剂体积、分散剂种类、分散剂体积对萃取效率的影响，结果见图1。 除上述筛选萃取条件优化外，本实验还考察了细胞接种密度(1×10 2.1.3 分离人细胞的活性成分 本研究中脱乙酰巴卡亭、巴卡亭Ⅲ、紫杉碱M、去乙酰紫杉醇、三尖杉宁碱、紫杉醇、浆果赤霉素、金松双黄酮、云南紫杉烷被作为活性成分筛选的模型化合物，红豆杉作为中药的研究对象。 CF-DLLME-HPLC提取TCE与A549细胞孵育不同时间，细胞上清液成分变化如图2所示。潜在活性成分可以根据孵育前后化合物峰面积的变化而推测。如图2所示，培养时间从1 h延长到24 h，可以观察到活性成分显著变化，1 h孵育后，6-紫杉醇的含量逐渐降低并且趋于稳定，4-去乙酰紫杉醇、5-三尖杉宁碱、9-云南紫杉烷、X1的含量随培养时间增加逐渐降低，可推测为几种化合物由于跟细胞有结合所导致;3-紫杉碱M和8-金松双黄酮没有显著变化，可能是因为他们不被细胞吸收所导致。 2.2 hff-hplc方法 2.2.1 提取中空纤维 将细胞悬液转移至细胞冻存管中，将细胞吹打均匀。用无针头的1 ml注射器轻轻将细胞悬吸入，用镊子辅助装上针头。用镊子夹取中空纤维平放于培养皿的上方，在中空纤维一边插入装有细胞悬液的注射器针头，将细胞悬液注入到中空纤维中，直至另一头溢出细胞悬液为止，将注满细胞悬液的中空纤维平放于培养皿中，向培养皿中加入5 ml培养液使得培养液没过中空纤维，之后放于培养箱中培养24 h待用。 取红豆杉提取液(TCE)500μl置于10 ml玻璃小瓶中，加入4.5 ml在37℃恒温处理的pH 7.4磷酸缓冲液，放入搅拌子并固定于磁力搅拌器上。将预先种植好A549细胞的聚丙烯中空纤维弯成U形，将两端用棉线封口，放入上述的中药提取液的小瓶中。在模拟人体环境下，匀速搅拌筛选3 h。筛选结束后将中空纤维从中药提取液中