磷脂酶1a辅助蛋白基因plaa1的基因克隆及酶学性质分析.docxVIP

磷脂酶1a辅助蛋白基因plaa1的基因克隆及酶学性质分析 磷脂酶a1（pholipas1，plaa1）广泛应用于食品、医疗、纺织业。它主要用于从植物中去除油脂。 对Pla S进行生物信息学分析发现，Pla S属于锚蛋白（Ankyrin,ANK）家族中的ANK2家族，根据Gen Bank(Protein-ID:AFN44705.1）数据分析，其蛋白结构是由N端、ANK区域和C端三部分区域组成，其中ANK区域包含4个典型的ANK重复序列（ANK reapeat）。ANK是一种胞内连接蛋白，为单链多肽，通常由若干个ANK repeat串联而成，每一个ANK repeat包含30～33个氨基酸，组成β2α2的“L”型结构 基因剪接技术已经成为分子截短的重要研究手段。为了揭示Pla S对Pla A1的调控机制，朱昊等 为进一步探究Pla S对Pla A1酶活的关键作用区域，本研究从Pla A1和Pla S共表达基因pla B的C端处开始剪接，并对截短菌株进行了胞外酶学性质研究，为后期阐明Pla S对Pla A1胞外酶活的调节机制提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 1.1.1 plab基因载体 BP28工程菌，携带pla B基因（Gen Bank Accession No.JX138536.1），由本实验室构建；pla B基因来源于黏质沙雷氏菌PL-06，其含有编码Pla A1的基因pla A1与辅助蛋白基因pla S;BL21(DE3),JM109分别作为Pla A1及其截短基因的表达载体和克隆载体；选择质粒p ET-28a（+）作为基因载体。 磷酸氢二钠、柠檬酸、磷酸二氢钠、甘氨酸、氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。 1.1.2 培养基的制备 L B培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨1 0 g，氯化钠10 g，蒸馏水定容到1 000 m L，调p H值至7.0。 PLB固体培养基：LB培养基84.5 m L,10%卵磷脂10 m L,0.01%溴甲酚紫3 m L,1 mol/L Ca Cl 乳糖自诱导培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，乳糖5 g，磷酸氢二钠0.025 mol/L，磷酸二氢钠0.025 mol/L，硫酸镁1 mmol，甘氨酸7.5 g，葡萄糖0.8 g，蒸馏水定容至1 000 m L,115℃灭菌15 min。 1.2 dycp-33d水平电泳槽 E L 2 0 p H计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；冷冻高速离心机赛默飞世尔公司；DYCP-31D水平电泳槽北京六一仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；凝胶成像系统美国Syngene公司；基因导入仪宁波新芝生物科技股份有限公司；PCR仪美国Bio-Rad公司；常压室温等离子体育种机北京思清源物科技有限公司。 1.3 方法 1.3.1 氨基酸序列的分析 将Gen Bank上公布的黏质沙雷氏菌PL-06 Pla A1辅助蛋白Pla S的氨基酸序列（Protein-ID:AFN44705.1）在NCBI网站（/）进行在线分析。根据辅助蛋白的氨基酸序列的分析结果，设计辅助蛋白截短突变体。 1.3.2 质粒dna的制备 本研究利用实验室先前构建的一株产Pla A1工程菌BP28，在含δ50卡那霉素的LB液体培养基中培养工程菌BP28，于37℃摇床充分振荡培养12～16 h。按照S a n P r e p柱式质粒DNA小量抽提试剂盒进行制备质粒DNA样品。 以p ET-28a(+)-pla B质粒为模板，根据表1的引物，用Taq酶进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增，扩增34个循环，条件如表2所示。对扩增后的片段进行胶回收，Bam HI、Hind III双酶切之后利用PCR纯化试剂盒进行纯化，纯化后的样品分别与p ET-28a（+）载体连接，并转化至BL21(DE3）感受态细胞中。在PLB平板中挑取阳性菌株送入南京金丝瑞公司进行测序验证。 1.3.3 培养乳液中无专酸4.5%诱导发酵 分别从PLB平板上挑取阳性转化子，接种到含有δ50卡那霉素的5 m L LB试管中，37℃、200 r/min摇床过夜培养，活化后按1%接种量接入含有δ50卡那霉素的100 m L乳糖自诱导发酵培养基中，37℃、200 r/min培养8 h。将发酵终点后的发酵液于12 000 r/min、4℃离心2 min，上清液即为胞外粗酶液。由于各菌中的Pla A1蛋白表达量较低，表达水平无法计算，蛋白纯化较为困难，因此后续采用胞外粗酶液进行酶学性质的研究。 1.3.4 截短细菌酶活性测定 1.3.4. 1.酶活性测定 参考文献 1.3.4. plb平板观察 将灭过菌的牙签，分别蘸取各突变菌