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苹果栽培品种的荧光ssr分析 苹果是世界上最重要的果树之一。中国是世界上最大的苹果生产国，每年的苹果产量也超过了世界排名。苹果品质资源复杂多样，加之我国乃至世界各地的频繁交流，很容易造成苹果种质的混杂，为了对苹果种质资源进行保护，有必要对苹果品种资源进行准确鉴定，这也是对苹果种质资源保存和利用的前提，更是对其进行知识产权保护的必要手段。 SSR标记是特异性强的一类分子标记技术，具有共显性、丰富的多态性、高度重复性及可靠性，同时操作简单等优点，近年来应用非常广泛 本研究通过对选取的山定子和我国华北地区种植面积相对较大的25份苹果栽培品种作为试验材料，运用荧光SSR分子标记技术对供试材料进行分子鉴定，并在此基础上对供试材料进行了遗传多样性分析，同时建立了各供试材料的指纹图谱和分子身份证，并在分子水平对山定子作为最常用苹果砧木进行了验证，旨在为苹果种质资源的利用与知识产权保护提供理论基础。 1 材料和方法 1.1 家果皮种质兴城苹果家庭栽培品种 为保证供试材料的可靠性，本研究选用的试验材料均取自国家果树种质兴城苹果圃，包括砧木系材料1份（山定子），栽培品种25份，其中，美国育成品种11份、日本育成品种7份、我国育成品种6份、加拿大育成品种1份（表1）。 1.2 测试方法 1.2.1 春季落叶松基因组dna的提取 采用德国QI-AGEN的DNeasy Plant Mini Kit的DNA试剂盒提取供试材料春季嫩叶基因组DNA。 SSR引物序列选择扩增片段长度100～300 bp，结合HOKANSON等 1.2.2 退火in PCR反应体系和PCR程序参照文献 PCR程序：94℃预变性5 min;94℃变性1 min，退火1 min（退火温度因引物而异），72℃延伸2 min,32个循环；72℃延伸10 min;4℃保存。 PCR扩增采用乙醇进行纯化，95℃变性5 min，在美国ABI 3730基因测序仪上对纯化后的SSR荧光标记产物进行荧光检测，并对原始数据进行收集。 1.2.3 分子身份证构建 在前期筛选出的16对荧光SSR引物中进一步筛选出7对SSR核心引物用于分子身份证构建。这7对SSR核心引物能对本研究选用的试验材料进行有效的区分，其分别是GD142、GD147、GD162、CH01h01、CH01f02、H02d08、CH02d12。 1.3 ssr数据的计算及分析方法 对ABI3730基因测序仪上获得的不同样品的指纹数据（即不同样品在每个SSR位点的扩增片段长度）利用Gene Mapper 3.0软件进行分析。遗传数据分析利用软件GenAl Ex 6.501进行，计算遗传多样性指标多态性等位基因数（Na）、SSR位点的有效等位基因数（Ne）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、香农多样性指数（I）以及固定指数（F）等。 采用Jaccard相似系数，对供试材料的SSR数据应用NTSYS-pc 2.10e软件进行计算，得到相似系数矩阵，然后利用UPGMA(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Mean）方法进行聚类分析，从而构建出供试材料基因型间的亲缘关系树状图。 利用Pop Gen 32软件对获得的供试材料的指纹数据进行分析，得到各荧光SSR引物多态性，然后将每对引物获得的等位基因从小到大按照顺序进行排序，并对排列的等位基因用阿拉伯数字从0开始赋值，对供试材料在7个SSR位点获得的等位基因按照赋值数字分别进行编码，即可获得每份供试材料独有的字符串。在此基础上，将每份材料按照相同位点顺序排列的编码字符串利用条码技术转化成每份材料独特的条码标识，即得到不同材料的分子身份证。 2 结果与分析 2.1 荧光ssr位点监测和浓度系统 16对荧光SSR位点的遗传多样性进行特征分析，结果如表3所示。 对供试的26份材料基因组DNA在16对荧光SSR标记的位点进行PCR扩增，共得到139个多态性等位基因，其中，多态性等位基因数在5(NH015a）和11(CH05e03）之间，平均等位基因数（Na）为7.938，供试样品在每个荧光SSR位点产生2个相同（表现为单峰）或不同（表现为双峰）的等位基因数；有效等位基因数（Ne）在2.711(GD147）和6.563(GD142）之间，平均值为4.123；观察杂合度（Ho）在0.654和0.962之间，平均值为0.802；期望杂合度（He）在0.631和0.848之间，平均值为0.743；无偏杂合度期望值（u He）在0.644和0.864之间，平均值为0.758；香浓多样性指数（I）在1.147和1.977之间，平均值为1.616；固定指数（F）平均值为-0.082（表3）。 2.2 ssr引物扩增带型检测 利用筛选出的16对SSR荧光引物对