生川乌遗传毒性的试验方法选择.docxVIP

生川乌遗传毒性的试验方法选择 采用治疗疾病的方法，具有益气、降压、镇痛、抗炎等多种药理活性。本药具有很强的毒性。常用的生川乌、生草乌和生附子属于国家特殊处理的毒性中药。 本文选用目前新药遗传毒性评价中推荐使用的3种试验 (小鼠骨髓微核试验、鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验、体外CHL细胞染色体畸变试验) 研究生川乌提取物的遗传毒性。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 制备滤液、制备滤液 生川乌提取物, 其制备方法为:加10倍量水浸泡30 min后, 煎煮2 h, 过滤, 残渣中再加10倍量水煎煮2 h, 过滤, 合并滤液, 70℃减压浓缩至1︰1体积备用。生川乌浓度为1.3 g生药/ml。 1.1.2 动物合格 SPF级NIH小鼠50只, 体重25~30 g, 雌雄各半。购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 动物合格证号:SCXK (沪) 2004-0005。小鼠饲养于国家成都中药安全性评价中心SPF动物房, 饲养条件符合国标GB 14922.2-2001。 1.1.3 rs国际及表现 选用TA97、TA98、TA100、TA1535、TA102菌株进行试验, 菌株购自Discovery Partners International, Inc.USA。按照试验要求, 对试验拟用的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型菌株进行了组氨酸需求试验、结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素试验、抗四环素试验、紫外线敏感试验、自发回变试验、阳性对照试验, 结果显示:各菌株的特性正常, 自发回复突变菌落数均在正常范围内, 阳性对照的回复突变菌落数高于相应菌株自发回复突变菌落数两倍以上。 1.1.4 细胞生物学研究 中国仓鼠肺成纤维细胞 (Chinese Hamster Lung fibroblast, CHL) 购自中国科学院上海细胞生物学研究所。 1.2 方法 1.2.1 环磷酰胺检测 将检疫合格的SPF级NIH小鼠随机分为5组, 每组10只, 雌雄各半。包括:生川乌3个剂量组 (26.0、13.0、6.5 g生药/kg) 、阴性对照组、阳性对照组。受试药物组小鼠每天给药1次, 连续4 d经口灌胃给药, 灌胃体积为0.2 ml/10 g。阳性对照组于处死前1 d腹腔注射环磷酰胺 (40 mg/kg) 。于末次给药后24 h (阳性对照组于给予环磷酰胺后24 h) 颈椎脱臼法处死小鼠, 取出胸骨骨髓制片, 计数1 000个多染红细胞, 并记录微核发生率 (‰) , 同时计数200个红细胞, 求出多染红细胞/正染红细胞的比值。 1.2.2 受试物剂量组见表1 根据预试结果, 生川乌提取物的高剂量组设为5 mg生药/皿, 以下依次作2倍稀释。试验设6个受试物剂量组 (5.000、2.500、1.250、0.625、0.313、0.156 mg生药/皿) , 1个自发对照组, 1个阳性对照组, 共8组。每组3个平行皿, 实验结果以每皿回变菌落数表示。平行做加和不加S9的试验, 试验重复1次。阳性对照药物使用情况见表1。 1.2.3 室外chl细胞染色体畸变试验 依据生川乌提取物LC 2 结果 2.1 小鼠骨髓微核试验 试验结果显示:阳性对照组小鼠骨髓细胞微核发生率明显高于阴性对照组, 且差异有统计学意义 (P﹤0.05) 。生川乌各剂量组小鼠骨髓细胞微核发生率与阴性对照组比较无明显升高, 差异无统计学意义 (P﹥0.05) ;各给药剂量组多染红细胞/正染红细胞的比值与阴性对照组比较, 差异无统计学意义 (P﹥0.05) 。表明生川乌对骨髓细胞无明显抑制作用。见表2。 2.2 回复突变试验 在加与不加S9的条件下, TA1535、TA97、TA98、TA100、TA102的自发回变菌落数均在正常范围内, 5个菌株的阳性对照均高于相应的自发回变菌落数两倍以上, 证明试验系统可靠。生川乌提取物各剂量组回变菌落数均未高于相应菌株自发回变菌落数的两倍, 且无剂量反应关系。试验重复一次, 所得结论相同。生川乌提取物Ames试验结果见表3、4。 2.3 室外chl细胞染色体畸变试验 在加S9和不加S9的情况下各剂量组的细胞染色体畸变率都低于5%, 通过χ 3 体外chl细胞染色体畸变试验 由于在小鼠急性毒性试验中未测出LD 综合3个试验的结果显示:在本实验室条件下, 生川乌提取物在小鼠骨髓微核试验、Ames试验及体外CHL细胞染色体畸变试验中均为阴性结果, 体外试验均重复1次, 所得结论相同。故认为在本实验室条件下, 生川乌提取物无遗传毒性。