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天然红色素灵菌红素的食品安全评价 灵菌红素是一种天然色素，是由含有糊精性沙雷氏菌等微生物合成的一级代谢产物。 本课题组已从鱼肠道中分离出一种高产灵菌红素的微生物 1 材料和方法 1.1 菌株、实验动物和仪器 本研究采用的灵菌红素是由本课题组筛选获得的粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) HFUT 1301发酵大豆油表达的次生代谢产物, 经过离心沉淀收集菌丝体, 超声波辅助乙醇萃取浸提以及硅胶色谱分离纯化, 纯度为95% SPF级健康昆明小鼠由常州卡文斯实验动物有限公司提供, 生产许可证号:SCXK (苏) 2011-0003。 环磷酰胺、叠氮钠、2-氨基芴、狄克松、1, 8-二羟蒽醌、二甲基亚砜Sigma-Aldrichi (中国) 公司;大鼠肝匀浆S-9混合物 (S9) 上海宝录生物科技有限公司。 1.2 设备和设备 80i光学显微镜日本尼康公司;普通生物显微镜日本奥林巴斯公司。 1.3 方法 1.3.1 清洗消毒,杀菌杀菌 实验前对SPF动物实验室、饲养笼、饮水瓶以及实验设备和器具等进行清洗消毒, 紫外杀菌;为提高小鼠的环境适应能力, 将小鼠在喂养室喂养3 d, 观察其生命活力及饮食饮水状况, 确定实验动物为健康小鼠, 小鼠灌胃体积为0.2 m L。 1.3.2 混悬液和淀粉的配制 小鼠急性经口毒性实验 (限量法) 选用体质量为18~22 g的健康小鼠20只, 其中雌雄各10只, 分两组;实验前禁食6 h, 自由饮水。小鼠一次灌胃体积0.2 m L, 将分离得到的纯度为95%的灵菌红素与淀粉混合获得混悬液, 含灵菌红素含量约为200 mg (根据小鼠体质量进行适当调整) , 确保喂饲灵菌红素的剂量达到10.0 g/kg (以体质量计) 。一次性给予受试物后继续禁食1.5 h, 然后正常饲养, 连续观察14 d;每天观察实验小鼠的进食情况、活动能力、粪便有无异常及精神状况, 观察是否存在中毒症状以及死亡情况, 每隔7 d称体质量并记录, 分析体质量的变化。14 d后剖检存活小鼠, 分割心、肝、脾、肺和肾等器官, 并进行称质量, 计算脏体比;制备肝脏切片, 光学显微镜观察细胞形态并进行病理组织学分析。 1.3.3 遗传毒性试验 1.3.3. 空白对照、溶剂对照和阳性对照 平板掺入法采用经鉴定符合要求的4株组氨酸缺陷型鼠伤沙门氏菌 (TA97、TA98、TA100和TA102) 。灵菌红素的质量浓度设置为50、158、500、1 580μg/皿和5 000μg/皿, 并设置空白对照、溶剂对照 (二甲基亚砜) 和阳性对照 (叠氮钠、狄克松、2-氨基砜、1, 8-二羟蒽醌) 。每组加大鼠肝匀浆S-9混合物和不加S9的均设置3个平板, 37℃恒温培养48 h, 观察实验结果, 统计培养基平板上菌落数。以实验菌株的回复突变数等于或大于空白对照组的2倍, 且具有明显剂量-效应关系定为阳性, 小于2倍确定为阴性。 1.3.3. 小鼠经口毒性实验 选择7~12周龄, 体质量25~35 g的健康小鼠50只, 雌雄各半, 随机分为5组, 每组10只。阳性对照组剂量为40 mg/kg (以体质量计, 下同) 的环磷酰胺, 阴性对照组为等量的淀粉溶液, 由经口毒性实验结果将灵菌红素的剂量设为2.5、5.0、10.0 g/kg, 经口灌胃, 第1次灌胃后间隔24 h后第2次给予受试物, 而后6 h颈椎脱臼处死小鼠, 取股骨, 剪去两端, 小牛血清多次冲洗, 制成细胞悬液, 涂片, 自然干燥后放入甲醇中固定5~10 min, Giemsa染色10~15 min, 然后立即用蒸馏水冲洗, 干燥, 标签记录, 保存。从小鼠眼眶采血, 制成血涂片。普通生物显微镜油镜下对每个动物的骨髓涂片, 观察2 000个噬多染红细胞, 统计有微核的噬多染红细胞数, 计算噬多染红细胞与成熟红细胞比例 (PCE/NCE) 。 1.3.3. 小鼠灵菌红素合成经口急性毒性实验 选取6~8周龄体质量为25~30 g的成年雄性小鼠25只, 随机分为5组, 每组各5只。阳性对照组为剂量为40 mg/kg (以体质量计, 下同) 的环磷酰胺, 阴性对照组为等量淀粉。由经口急性毒性实验将灵菌红素剂量设为2.5、5.0、10 g/kg。经口灌胃5 d, 每天1次, 于受试物首次给予35 d后取颈椎脱臼处死小鼠, 解剖, 取出两侧附睾盛放于含有2 m L生理盐水的平皿中, 将附睾纵向剪1~3刀, 静置3~5 min后, 轻微摇动, 过滤, 吸取滤液涂片;干燥后置于甲醇中固定5~10 min, 伊红浸泡染色时间1 h, 灭菌蒸馏水轻冲洗, 去除表面杂物, 光学显微镜下观察精子形态, 每只小鼠样品涂片鉴定1 000个小鼠精子, 分析精子形态类型, 统计畸形数, 计算畸形率。 2