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经典药用植物丁香假单胞菌dc2000甘油激酶基因克隆及功能研究 谭氏反真菌番茄致病性变异（pseudyer亚甲基卤单胞菌（pst）d3000是番茄、青椒和其他茄子植物的病原体。这是属于丁香假单胞菌的。革命兰的阴性短杆菌，有鞭毛，无瘤膜，无芽。最佳ph值为7.0，最佳生长温度为2430，黄绿色荧光在kbm培养基中产生。 甘油是一种代谢中间产物, 广泛存在于微生物、动物和植物中, 参与生物的多种胁迫反应, 包括非生物胁迫和生物胁迫 甘油在甘油激酶 (Glycerol kinase, GK) 的催化下, 分解形成3-磷酸-甘油 (G3P) 。G3P在辅酶NAD 鉴于GK是甘油代谢中的关键酶, 结构相对保守, 本研究根据Gen Bank中Pst DC3000 GK氨基酸序列 (PSPTO_4168) 设计引物, 通过PCR技术克隆了Pst DC3000 GK基因, 并对其生物信息学特征进行了分析。然后, 利用插入突变的方法, 敲除Pst DC3000 GK基因, 探讨GK基因缺失对Pst DC3000的影响。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 质粒及试剂 野生型Pst DC3000、大肠杆菌DH5α、质粒 (p K18mob、p LAFR、pRK2073) 均由贵州理工学院微生物学实验室保存。克隆载体p MD-18-T购自TAKARA公司。 1.1.2 化学试剂的制备 蛋白胨、甘油、琼脂、常用抗生素购自上海生工生物有限公司;磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、无水乙醇、冰醋酸等均为分析纯, 购于广州化学试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自普洛麦格 (北京) 生物技术有限公司;DNA胶回收试剂盒、DNA纯化试剂盒购于上海生工生物有限公司;Taq DNA聚合酶、Ex TaqⅡmaster mix、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶等均为TAKARA公司产品。 1.1.3 培养基 1.2 测试方法 1.2.1 pstdc3000扩增gk基因 严格参考试剂盒说明书提取Pst DC3000基因组DNA, 通过核酸紫外分光法分析其质量与浓度。以Gen Bank中所提交的Pst DC3000 GK氨基酸序列为依据, 利用Primer 5.0分析软件, 设计1对克隆引物 (表1) 。 以Pst DC3000基因组DNA为模板, 通过PCR的方法扩增GK基因, 扩增条件为:95℃预变性5 min;94℃变性30 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸90 s, 35个循环;最后72℃终末延伸10 min。PCR结束后, 凝胶电泳分析, 通过DNA胶回收试剂盒进行纯化, 将产物连接至克隆载体 (p MD-18-T) 上, 通过热激法将重组DNA分子转化至DH5α感受态细胞中, Amp抗性和X-gal/IPTG蓝白斑筛选阳性克隆。挑取白色菌落进行PCR检测, 将阳性克隆进行液体培养, 采用试剂盒方法提取质粒后, 双酶切法进行检测, 挑选PCR检测与双酶切检测均为阳性的菌落, 送上海生工生物公司进行测序。 1.2.2 orf核心序列的发现与翻译 利用生物软件 (DNAMAN和Bio Edit) 对Pst DC3000 GK基因序列进行ORF查找与翻译。通过序列处理在线工具包 (SMS) 、瑞士生物信息学研究中心蛋白质专业分析系统以及国际生物测量学与进化生物学实验室在线系统等分析蛋白质理化性质。 1.2.3 pstdc3000gk氨基酸序列的分析 利用整合突变的方式, 借助辅助质粒pRK2073, 通过三亲本结合实现对Pst DC3000 GK基因的敲除。方法如下:根据Pst DC3000 GK氨基酸序列设计缺失突变引物 (表1) , 利用野生型Pst DC3000菌体基因组DNA为模板, 进行PCR扩增, 方法参考1.2.1。分别将受体菌Pst DC3000、供体菌 (带有重组质粒的DH5α) 、辅助菌DH5α/pRK2073接种在含适当抗生素的液体培养基中, 培养至OD 1.2.4 pstdc3000检测 根据Pst DC3000 GK氨基酸序列设计1对GK基因全长回复突变引物 (表1) 。以Pst DC3000菌体基因组DNA为模板, 进行PCR扩增, 方法参考1.2.1。将构建正确的回复突变质粒通过三亲本结合方式转化至GK基因突变体中, 实现GK基因缺失的回复突变。将构建正确的GK基因缺失回复突变体命名为Pst DC3000△GK/p LA。 1.2.5 gk蛋白表达量的检测 采用实时荧光定量PCR的方法 (罗氏Lightcycler 480系统) 检测Pst DC3000、Pst DC3000△GK及Pst DC3000△GK/p LA中GK的表达量。以16S RNA为内参, 扩增体系:10μmol/L引物各0.