纳米羟基磷灰石半水硫酸钙复合人工骨的生物安全性研究.docxVIP

纳米羟基磷灰石半水硫酸钙复合人工骨的生物安全性研究 人工骨材料的应用现状 针对临床上由伤口、肿瘤和感染引起的骨肿瘤性缺损，开发了多种人工骨替代品材料，并在实际应用中取得了良好的效果。而近年问世的一些可注射人工骨材料, 使用所需的创伤较常规材料更小, 已日益受到人们的重视。纳米级羟基磷灰石 (n H A) 和半水硫酸钙 (2 C a S O 1 材料和方法 1.1 生长覆岩体csh 实验用复合人工骨主要由n-HA晶体 (自行合成) 及半水结晶硫酸钙 (CSH, Sigma公司) 构成。其中n-H A晶体以共沉淀法 (1 4 0℃) 合成, 经透射电镜证实为棒状 (图1) , 直径100 nm, 平均长度69.5 nm (LS230型粒度仪, 美国贝克曼库特公司) ;CSH购自S ig m a公司, 均以射线照射灭菌 (剂量2 5 0 k G y) 。实验采用固化成型的圆柱状样品 (截面直径3.5 mm、高2.5 m m) , 复合材料以磷酸盐缓冲液作固化液, 二水硫酸钙为促凝剂, 液固比0.8 (g/ml) ;CSH以水为固化液, 液/固比0.35。MTT细胞毒性试验设置三组复合物样品, 其HA含量分别为10wt%、20wt%和40wt%, 其他测试均采用HA含量40wt%样品。 1.2 实验方法 1.2.1 材料浸提液制备 采用健康昆明小鼠24只 (由第二军医大学动物实验中心提供) , 雌雄各半, 体重在180克之间。动物随机分为3组:静脉实验和腹腔实验各1组, 每组10只;对照组4只。事先将2g已凝固的复合材料 (n-HA含量40wt%) 于生理盐水中浸提72小时 (37℃) , 获材料浸取液备用。所有动物称重后, 将上述浸取液于无菌条件下分别注入小鼠静脉及腹腔内, 对照组小鼠腹腔注射生理盐水 (空白对照) 。于注射后24、48和72小时观察所有动物的一般情况、中毒表现和死亡数量并作记录。试验组和对照组小鼠如出现中毒表现, 则根据其症状程度记为无中毒、轻度中毒、明显中毒、重度中毒和死亡 (表1) 。根据观察结果作出评价。 1.2.2 材料浸提液制备 采用健康新西兰大耳兔4只 (由第二军医大学实验动物中心提供) , 雌雄各半, 体重2.3~2.5kg之间, 随机编为1~4号。事先将2g已凝固的复合材料 (n-HA含量40wt%) 于生理盐水中浸提72小时 (37℃) , 获材料浸取液备用。实验前一天将动物背部脱毛 (脱毛剂 1.2.3 动物分组、材料浸提、注射2%二苯基氟苯 采用健康成年白化豚鼠16只 (由第二军医大学动物实验中心提供) , 雌雄各半, 体重36080g之间。分组方式为:实验组8只;阴性对照和阳性对照组各4只。事先将2g已凝固的复合材料 (n-HA含量40wt%) 于生理盐水中浸提72小时 (37℃) , 获材料浸取液备用。实验组在每只动物两侧肩胛骨内缘处均皮内注射浸取液0.1ml;阴性对照组注射生理盐水0.1ml;阳性对照组注射2%二硝基氟苯 (DNFB, 由上海同济大学生命科学院提供) 0.1ml。于注射后即刻和24、48、72小时观察局部皮肤反应, 并按表3所列标准记录每一激发部位和每一观察时间的红斑和水肿程度。 1.2.4 材料和模拟物质的制备 选择293T细胞株 (上海同济大学生命科学院提供) , 为传代48h2h生长旺盛的细胞。所用MTT (溴化-3- (4, 5二甲基噻唑-2) -2, 5二苯基四唑) 购自S i g ma公司。事先将3组复合材料 (n-HA含量1 0 wt%、2 0w t%、4 0 wt%) 、纯n-H A和纯硫酸钙在模拟体液 (Simulated body fluid, SBF) 中浸泡2周, 浸取液按100%、50%、10%浓度稀释, 以细胞培养液作阴性对照。用含10% (V/V) 小牛血清的DMEM (dulb e c c o’s m o di fi e d e ag l e me d iu m) 培养基配制3×1 0 1.2.5 致突变化比l 采用选择鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型细胞TA9 8、TA1 0 0作为指示菌株 (第二军医大学药物安全性评价中心提供) , 采用平皿掺入法进行。事先将复合材料 (n-HA含量40wt%) 以生理盐水浸泡72h, 浸取液以无菌生理盐水稀释成1 g/0.1ml、100 g/0.1ml、1 0 0 0 g/0.1 ml、2 0 0 0 g/0.1 ml和5 0 0 0 g/0.1 ml五个浓度等级。以已知致突变物叠氮化钠 (SA) 的1 g/0.1ml溶液、二氨基芴 (2-AF) 的10 g/0.1ml溶液、2, 7-二氨基芴 (2, 7-AF) 的100 g/0.1ml溶液为阳性对照, 生理盐水为阴性对照。在加大鼠肝脏微粒体酶系 S