克氏原螯虾血细胞的形态学研究.docxVIP

克氏原螯虾血细胞的形态学研究 胞养结合剂对克氏原螯虾胞免疫的作用 克罗伊斯托纳通常是一种常见的甲壳类动物。作为自身神经系统的主要组成部分之一，它对克罗伊斯托纳的正常生长活动和体液免疫以及细胞免疫起到了重要而不可替代的作用。 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 钠的合成 试验药品:姬姆萨染色液、苏丹Ⅲ染液、丙三醇、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、戊二醛、蔗糖、无水乙醇、70%酒精、柠檬酸、葡萄糖、EDTA、柠檬酸三钠。试验器材:水族缸、1mL注射器、量筒、烧杯、恒温箱、玻片、盖玻片、电子天平、移液管、移液枪、玻璃棒、记号笔、血球计数板、计数表、显微镜、镊子。 1.1.2 试验材料及分组 挑选肢体完整、无机械损伤、无病害、无畸形、个体大小基本一致的克氏原螯虾为试验材料。试验前将克氏原鳌虾在实验室内暂养160h左右, 每天定时定量投喂龙虾饲料和更换暂养水1～2次, 试验时挑选出50只体表完好无损、无病、活动能力强的克氏原鳌虾作为试验对象。 1.2 试验设计 1.2.1 玻片的下一步染色 取两片干净的载玻片轻轻置放在玻片台上面, 先用移液枪吸取固定剂0.02mL (1%的蔗糖、1%的戊二醛, 定容至100mL) 滴在其中一张玻片的一端, 然后从克氏原鳌虾心脏吸取0.01mL的血液快速滴在先前滴有固定剂的干净玻片上, 轻轻将另一张玻片倾斜放置于克氏原螯虾心脏血滴左端 (玻片的置放角度以30°～45°最适宜) , 向右均匀地将玻片推进至另一端, 倾斜4°固定30min后, 对涂片进行下一步的染色处理。 1.2.2 抗菌染色法 血涂片制作好之后, 可以采用GIMESA染色、瑞氏染色、苏丹Ⅲ染色、PAS染色对血涂片进行进一步的染色处理。经过染色处理后, 血细胞中的嗜碱性颗粒会被染色剂着染成为蓝色, 而嗜酸性颗粒则会被着染成为橙红色;血细胞中如果含有脂质成分将会被着染为橘红色;细胞中的多糖成分将被着染为粉红色。 1.2.3 红细胞dhc不同类型外周血计数,dhc和dhc总血红蛋白a的计数 将血涂玻片静置干燥后放置于100倍油镜的光学显微镜下观察血细胞中的颗粒、细胞质和细胞核的染色和分布情况。观察3种不同种类血细胞的数量, 每张涂片最少观察300～500个细胞, 并做好相关记录, 作为DHC原始数据。吸取500μL抗凝剂于Eppendorf离心管中, 同时在离心管中注入500μL克氏原鳌虾血液, 之后迅速将抗凝剂和克氏原螯虾血液混合均匀, 用Neubauer氏血球计数板进行计数, 作为THC原始数据。 1.2.4 统计分析 试验数据一律采用Excel软件进行统计分析, 数据结果取平均值±标准差 (Mean±SD) 。 2 结果与分析 2.1 细胞培养和细胞数量 在光学显微镜下对染色后的血涂片进行进一步的细致观察, 根据显微镜下观察到的血涂片中克氏原螯虾血细胞的形状、大小, 血细胞胞质中颗粒的大小、数量、折光性以及血细胞经过染色处理后颜色变化情况等对血细胞进行大致分类, 可以将克氏原螯虾的血细胞分为三大类型, 即透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞。 透明细胞 (hyaline cell, HC) , 一般近圆形, 少量呈不规则多边形, GIMESA染色和瑞氏染色后细胞核呈现淡蓝色, 细胞核在整个细胞中居中或稍微偏离中间位置, 细胞质几乎呈现透明状态, 细胞质内未发现类似颗粒状物质。苏丹Ⅲ染色结果显示细胞内不含脂质成分, PAS染色结果表明细胞内含有多糖成分。通过比较发现, 透明细胞在三种细胞中个体相对最小, 但核质比最高, 并且透明细胞中有一个相对较大的核;三类细胞相比之下, 小颗粒细胞与大颗粒细胞内部颗粒的数量均相对较多。 小颗粒细胞 (semi-granular cell, SGC) , 一般为月牙形或纺锤形, 少量呈椭圆形。经GIMESA染色和瑞氏染色后细胞核呈淡蓝色, 细胞质无色, 细胞质中含少量分布不均匀的淡蓝色小颗粒, 多数集中在细胞两端。苏丹Ⅲ和PAS染色结果表明细胞内不含脂质成分而含有多糖成分。 大颗粒细胞 (granular cell, GC) , 一般为长椭圆形, 极少量呈纺锤形。GIMESA染色和瑞氏染色后细胞质呈现淡红色, 且含有大量分布均匀的橙红色颗粒。光镜下能观察到大量折光性较强的大颗粒物质, 染色后细胞核呈现深蓝色, 细胞质呈现淡红色。长时间观察发现, 细胞核在细胞中有时会受到较多颗粒物质的挤压, 经常处于偏离中间位置的状态。苏丹Ⅲ和PAS染色结果表明细胞内不含脂质成分而含有多糖成分。 2.2 类细胞所占比例的比较 在光学显微镜下对6片克氏原螯虾血细胞血涂片进行观察并测量其血细胞的大小, 分别对三类细胞进行计数。细胞直径透明细胞最小, 为7.51μm, 小颗粒细胞次之, 为8.75μm, 大颗粒