周期性张应力对颅底软骨细胞型胶原和sox9表达的影响.docxVIP

周期性张应力对颅底软骨细胞型胶原和sox9表达的影响 在颅底之间有软骨样本组织，即总体银行软骨（ses）、总体银行软骨（is）和总关节软骨（sos）的联合。颅底软骨联合是重要的颅面骨骼生长中心, 在颅面部的生长发育中起到引导作用, 生长发育异常可影响上、下颌复合体 颅底软骨细胞为颅底软骨联合中唯一的细胞成分, 负责细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 的产生和降解。颅底软骨细胞合成的细胞外基质主要是Ⅱ型胶原 (typeⅡcollagen, Col-Ⅱ, COL2A1) 和聚集蛋白聚糖 (aggrecan) , Ⅱ型胶原合成的变化能直接反映外力作用下颅底软骨细胞的功能状态及机械应力对颅底软骨的影响。SOX9基因 (SRY-box 9) 是SOX基因家族的重要成员, 在软骨生成中起着关键的调控作用。本实验采用FX-5000T应力加载系统进行体外周期性张应变 (cyclic tensile strain, CTS) 加载, 应用RT-PCR技术检测颅底软骨细胞主要细胞外基质Col-Ⅱ以及Sox9 m RNA的表达变化, 探索颅底软骨细胞对周期性张应力刺激的反应规律, 了解机械应力作用下颅底软骨细胞的功能状态及代谢变化。 1 材料和方法 1.1 细胞培养和贮藏 1周龄和2周龄SD大鼠, 雌雄不限, SPF级 (购自中国科学院上海实验动物中心) ;双抗-青链霉素溶液 (Hy Clone公司, 美国) ;Ⅱ型胶原酶 (Sigma公司, 美国) ;0.25%胰蛋白酶 (Hy Clone公司, 美国) ;DMEM培养基 (Hy Clone公司, 美国) ;胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司) ;阿利新蓝染色液 (索莱宝科技有限公司) ;TRizol (Takara, 日本) ;Hi Script II Q RT Super Mix for q PCR (诺唯赞生物科技有限公司) ;Quanti Fast 1.2 实验方法 1.2.1 镜下染色 分别取1周龄和2周龄大鼠颅底组织切片, 脱蜡至水, 常规H-E染色, 镜下观察。在无菌条件下分离1周龄SD大鼠颅底软骨组织 (蝶筛软骨联合、蝶枕软骨联合) , 用镊子去除软骨表面纤维层, PBS充分漂洗, 以无菌手术刀将软骨切成1 mm 1.2.2 abc免疫细胞化学染色 取1周龄SD大鼠第2代细胞爬片, PBS洗去培养基, 4%多聚甲醛固定30 min, 按照ABC免疫组织化学试剂盒操作说明行Col-Ⅱ及Sox9免疫细胞化学染色, DAB显色;以不加一抗作为阴性对照。镜下观察细胞的表达。 1.2.3 颅骨工程力学刺激模型的建立 取1周龄SD大鼠第2代颅底软骨细胞用于后续加力实验。颅底软骨细胞以1×10 1.2.4 实时定量pcr检测 PCR检测Col-II和Sox9m RNA的表达加力完成后即刻收集细胞, 吸去加力板中的培养基, PBS冲洗2次, 用Trizol提取各组细胞的总RNA, 紫外分光光度计检测260/280 nm处吸光度 (A) 值比值, 计算RNA浓度。在RNA反转录成c DNA前, 使用反转录试剂盒去除基因组DNA, 然后再根据试剂盒操作说明, 将总RNA反转录形成c DNA。取上述各组c DNA样本, 以c DNA为模板, β肌动蛋白 (β-actin) 为内参照, 进行实时定量PCR扩增, 各基因引物序列见表1。按照RT-PCR试剂盒说明书操作, 在荧光定量PCR仪上进行RT-PCR反应。反应条件:95℃预变性10 min;95℃变性10 s、60℃延伸30 s, 40个循环。采用2 1.2.5 亚利斯蓝色染色 对加力24 h组和对照组 (0 h) 颅底软骨细胞分别进行阿利辛蓝染色, 倒置显微镜下观察, 并用图像分析系统采片。 1.2.6 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳sds 吸出培养板中的培养基, PBS冲洗2次, RIPA裂解液冰上裂解细胞, 提取24 h组和对照组细胞总蛋白, 采用BCA法进行蛋白定量。等量蛋白 (20μg) 上样, 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS) , 电转移蛋白到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入Sox9一抗 (1∶200) β-Actin一抗 (1∶5000) , 4℃孵育过夜;磷酸盐吐温缓冲液 (PBST) 洗膜3次, 每次10 min。加入辣根过氧化物酶HRP标记的二抗 (1∶10000) , 室温孵育1 h, 增强化学发光法 (ECL) 显示蛋白条带。在凝胶成像仪上检测条带, 采用Image J软件分析条带灰度值, 以目的蛋白条带灰度值与内参β肌动蛋白灰度值的比值作为蛋白相对表达量。 1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件包对数据进行统计分析, 计量数据以