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香蕉枯萎病木霉的体外拮抗作用研究 香蕉是岭南四大优良水果之一，在广东、海南、广东等地种植面积较大。近年来，香蕉枯萎（富有生物科学）相继发生在广东省、广东省、广东省和其他土地上。这种疾病具有很强的抗旱性，可以长期生活在土壤中。香蕉枯萎病是典型的土传病害,侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤,病菌从寄主根部伤口侵入寄主,通过寄主维管束向假茎上部及叶部蔓延,使香蕉生产受到了极大的威胁,香蕉产业面临被摧毁的危险。目前防治枯萎病的主要方法是培育抗病品种、使用化学药剂和利用农业措施等,但还没有一种理想的防治香蕉枯萎病的化学药剂,研制药效持久、且对人体和生态环境无害的生防菌剂成为我国乃至全世界的发展方向。拮抗性木霉是一种很好的生防微生物,广泛分布于土壤、空气、枯枝落叶及各种发酵物上且极易分离和培养,据报道木霉能对18个属中29种植物病原真菌有拮抗效果,木霉作为一种具有重要开发价值的自然资源正逐渐被农业生物防治领域研究、开发和利用。已报道用于防治致病性尖孢镰刀菌引起枯萎病的主要有哈茨木霉(T.harz ianum)、绿色木霉(T.viride)和拟康氏木霉(T.pseudokoningii)等。笔者对拮抗香蕉枯萎病镰刀菌的木霉菌株进行分离筛选,以期为香蕉枯萎病的防治提供基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 试验中的菌株和材料 1.1.2 培养基和实验设备 改良的马丁氏-孟加拉红培养基、PDA、电子天平、p H酸度计、振荡器、摇床、三角瓶、涂玻棒、无菌操作台、酒精灯等。 1.2 方法 分别在海南儋州、霸王岭、尖峰岭、广东湛江等地采集土样进行分离,4次采集共152份土样(表1)。根据采样地点、采集基质类别进行编号。 1.2.2 微生物数量的测定 (1)土壤悬浮液制备:称取土壤稀释成悬浮液至10-2、10-3、10-4;(2)木霉选择培养基配置:即改良的马丁氏-孟加拉红培养基;(3)平板涂布:将土壤稀释悬浮液在振荡器上振荡10~20 s,吸取100μL溶液至平板中央,用涂布棒涂匀,并做好浓度标记,涂好的平板正放静置5 min,使溶液渗透进平板中,重复3次,将涂好的平板用黑色塑料袋包好倒置于28℃人工气候箱中培养3~5 d;(4)结果计算:每克土样中微生物的数量=同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品克数。纯化的木霉菌在平板上培养,用打孔器打取菌碟,置于平板上,恒温培养箱培养定期观察菌落生长情况,菌株筛选以菌落均匀一致、菌丝丰富且产孢量大为指标。 1.2.3 木霉和尖孢镰菌生长距离的测定 (1)菌株筛选:用大板,木霉生长速度比较快,很快占优势,所以这个步骤要病原菌的孢子浓度高达108而木霉的孢子浓度106即可;(2)对峙培养:将大板筛出的理想菌株与病原菌做对峙培养,即将木霉和尖孢镰刀菌点接在平板两边缘,相距5~6 cm,倒置放入28℃恒温培养箱中培养,重复3次,以仅接种尖孢镰刀菌菌株为对照,定期观察木霉对其抑制作用,并记录菌落生长半径及相互作用情况,同时做木霉和尖孢镰刀菌的纯培养试验并记录菌落满皿时间。测试项目及记载标准如下:接种后168 h测量尖孢镰刀菌菌株的直线生长距离dB和dCK,木霉菌株的直线生长距离dT按以下公式计算抑菌率:抑菌率/%=(dCK-dB)/dCK×100(dCK:对照组接种尖孢镰刀菌后168 h的直线生长距离;dB:对峙培养组接种枯萎病菌后168 h的直线生长距离;dT:木霉接种平板后168 h的直线生长距离);(3)对峙培养72 h后,挑取两菌落交界面菌丝制片,用显微镜观察木霉与病原菌交集处菌丝生长情况并跟踪观察。 1.2.4 抗菌作用测定 木霉代谢产物分为挥发性与难挥发性物质,木霉菌的抗生作用就测这两类代谢产物对病原菌的拮抗作用。(1)难挥发代谢产物抑菌作用的测定用圆盘滤膜法测定:在PDA平板上,平铺上直径略大于9 cm的双层玻璃纸(硝酸纤维素膜),在平板中央接种已活化3 d的供试木霉菌块(d=5 mm),每个处理重复3次,28℃培养,待供试木霉菌落直径达5 cm后去玻璃纸,再在平板中央接种直径为5 mm尖孢镰刀菌,28℃培养5 d。以不含供试木霉菌株代谢产物的PDA平板接种尖孢镰刀菌为对照。接种后第2天开始观察,分别用十字法测定菌落的生长半径,计算抑制率,考察抗生作用。(2)易挥发代谢产物抑菌作用采用对扣法测定,将活化3 d的供试木霉菌株菌丝块,接种于PDA平板中央,28℃恒温培养箱内培养。待菌落直径达5 cm时,取出菌块,在其上盖上双层直径略大于10 cm的无菌滤膜,上方扣一个相等大小、中央刚接种尖孢镰刀菌菌丝块的平板。用透明胶带密封后,以未接供试木霉菌株的PDA平板与接种尖孢镰刀菌平板对扣培养作为对照,在28℃恒温培养箱内培养,每处理重复3次,连续培养5 d,测定对尖孢镰刀菌生