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高效液相色谱法测定芝麻中的木酚素 芝麻是6000年前使用最古老的油料厂品之一。近年来,芝麻或芝麻油中的木酚素引起了世人的极大关注。木酚素是一类脂溶性抗氧化物质,在芝麻中的含量很低,约占0.5%~1.0%,主要包括芝麻酚(Sesamol)、芝麻素(Sesamin)和芝麻林素(Sesamolin)。芝麻油中虽然含有大量不饱和脂肪酸,但其氧化稳定性高于其他植物油,现有研究表明,木酚素的抗氧化活性是保持芝麻油中不饱和脂肪酸稳定性的主要原因。此外,该类化合物还具有促进乙醇代谢、调节血脂代谢、抗癌、保护中枢神经系统及调节免疫等功能。 芝麻油中的木酚素含量不仅是评价芝麻油品质的重要指标,也是培育优良芝麻品种的重要判定依据。目前,已报道的检测方法主要有显色法、紫外分光光度法、薄层色谱法、气质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)以及液相色谱-核磁共振-质谱联用法(LC-NMR-MS)等。HPLC法可定性和定量分析木酚素,其分析时间短,重现性好,准确可靠,是目前的常用分析方法,但现有方法多为芝麻酚、芝麻素、芝麻林素的单项检测,本文在已有研究的基础上,建立了芝麻酚、芝麻素、芝麻林素同时定量检测的HPLC法,并对市售芝麻油进行鉴定。 1 材料和方法 1.1 化学计量比的测定 20种芝麻油和3种芝麻色拉油(购于南京家乐福);无水甲醇、正己烷、乙酸乙酯(分析纯)购于上海国药化学试剂有限公司;99%芝麻酚(南京泽朗医药科技有限公司);芝麻素和芝麻林素的标准品为实验室自制,化合物为白色结晶。芝麻素UV(Me OH)(λmaxnm):236,287。EI-MS m/z 377[M+Na]+。经HPLC检测,纯度为99%。芝麻林素UV(Me OH)(λmaxnm):236,289。EI-MS m/z 393[M+Na]+。经HPLC检测,纯度为99%。 1.2 高效液相色谱法 AY-120电子精密天平;BL-220H分析天平(日本Shimadzu);HH-4数显恒温水浴锅(江苏国华电器有限公司);Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Heidolph Laborota 4000真空旋转蒸发仪(德国Heidolph);玻璃层析柱1.6×30 cm;Kieselgel 60(0.063~0.200 mm)购于MARK公司(德国Darmstadt)。 1.3 实验方法 1.3.1 木酚素的提取 准确称取1 g芝麻油,溶解于乙酸乙酯,上Kieselgel 60硅胶柱,以梯度浓度的甲醇和正己烷洗脱,浓度梯度从90∶10到30∶70(V/V),每次洗脱液中正己烷的含量增加10%,取1 m L收集到的洗脱液旋转蒸发除去溶剂,再添加5 m L甲醇震荡、静置,取上清液于290 nm下测定其吸光度,合并吸光度较大的的洗脱液,旋转蒸发后,获得木酚素粗提物。 1.3.2 填料检测方法 色谱柱:Agilent(C18,4.6 mm×150 mm,填料粒度5μm);检测器:Agilent1100紫外检测器;流动相:甲醇∶水=70∶30(V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:290 nm;柱温:35℃;进样量:20μL。 2 结果与分析 2.1 天麻林素浓度和峰面积的线性关系 配制不同浓度的芝麻酚、芝麻素和芝麻林素标准溶液,以HPLC法测定各组分的峰面积。芝麻酚浓度和峰面积的线性关系为:y=33.91x-26.17,相关系数r=0.999 9;芝麻素浓度和峰面积的线性关系为:y=27.978x+28.106,相关系数r=0.999 9;芝麻林素浓度和峰面积的线性关系为:y=25.554x-8.080 8,相关系数r=1。结果表明芝麻酚、芝麻素和芝麻林素在5~200μg/mL范围内线性很好。 2.2 原因样品检测 按照1.3.1所述的方法对样品进行预处理后进样分析,结果如图1。 从图1可知样品处理液有3个峰,其分离度高,峰形尖锐,基线平稳,且检测可在10 min之内完成。对比标准样品HPLC图谱,可知芝麻酚、芝麻素和芝麻林素的保留时间分别为2.281 min、6.397 min和8.158 min。Kamal-Eldin等人报道的正己烷-氯仿(2∶1,V/V)溶解的方法检测芝麻油中木酚素类物质,存在分离度过小的问题,导致实验数据不够准确。本文以甲醇溶解样品,利用Agilent C18做为分离柱,可以较好解决分离度不足的问题,可实现3种成分的同时定量分析。 2.3 精密度 取某一种芝麻油,按照1.3.1进行样品预处理,并在该色谱条件下进行检测分析(平行试验,n=5),并计算精密度RSD。由公式RSD=S/X计算得:芝麻酚的RSD为1.97%,芝麻素的RSD为1.73%,芝麻林素的RSD为1.60%,证明本文所使用检测方法准确有效。结果如表1所示。 2.