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内毒素血症对非酒精性脂肪性肝炎的影响 近年来，肝脏疾病与内毒素血症的关系日益受到关注。大量动物实验及临床研究均表明各种肝脏损伤均可发生内毒素血症,其中非酒精性脂肪性肝炎(non-alcohol steatohepatitis ,NASH)在世界范围广泛分布,其发病率逐年上升。NASH也是部分患者隐源性肝硬化的重要原因。本研究观察了NASH模型8周、12周大鼠门静脉和腹主动脉血内毒素(endotoxin,ET)水平的变化及其肝脏的病理学改变,旨在阐明肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia,IETM)在NASH发病中起着重要的作用。 1 材料和方法 1.1 试剂盒和cd14 健康Wistar雄性大鼠36只,体质量180～220 g, 由山西医科大学实验动物中心提供,胆固醇购于南京建成生物工程研究所,猪油自备。鲎试剂盒购自上海伊华临床科技公司;CD14一抗、二抗均购于武汉博士德生物有限公司;红外线同位素能谱分析仪(IRIS)由德国瓦格纳公司生产。 1.2 大、小鼠血样功能检测 ①动物模型的制作参考钟岚脂肪性肝炎模型的建立,常规饲养1周后, 随机分为3组:对照组、模型组、治疗组(高脂饮食+5%甘氨酸)各组12只,实验动物自由饮水。②13C-美沙西丁呼气试验检测肝细胞功能。③动物处理 于实验第 8周、12周末,禁食过夜,次日称量体质量后以1.0%戊巴比妥钠(3.0 ml/100 g体质量,皮下注射)麻醉,手术开腹,在无菌无热原条件下,分别从门静脉、腹主动脉采血2.0 ml,离心4 000转/min,15 min,吸取上清液置-70℃保存,待测ET水平,所有血标本接触的器具均要求保证无污染;取肝右叶中部一块组织用10%甲醛固定、石蜡包埋、切片,做HE染色组织学观察以及免疫组化法检测CD14。 1.3 数据统计分析 所有数据均以均数±标准差(xˉxˉ±s)表示,采用SPSS 12.0统计软件对数据行单因素方差分析,两组间比较用SNK(q检验)以及配对t检验,以P0.05差异有统计学意义。 2 结果 2.1 两组大鼠门静脉et水平比较 ET水平检测结果8周、12周模型组大鼠门静脉ET水平与对照组比较均明显升高,治疗组大鼠门静脉ET水平有所降低,腹主动脉血ET与相对应门静脉ET比较有显著性差异(t值分别为-7.49、12.05、-6.68和-6.07,P0.01);腹主动脉各组间ET比较均无统计学意义。见表1。 2.21 治疗组与对照组治疗前后比较好,达峰时间后移、丰度相对提高 12周模型组大鼠的呼气峰值(DOB)与对照组比较有显著性差异,而且达峰时间较对照组前移,丰度明显增高,治疗组的DOB值降低,达峰时间后移,丰度降低;累积呼气量(CUM 60min)亦有统计学差异,8周实验结果均无统计学差异。 见表2。 2.3 肝组织he染色 光镜下,对照组大鼠肝组织结构完整、清楚,肝小叶结构正常,肝细胞排列成肝索状,在中央静脉周围呈放射状分布,细胞呈多边形;而高脂饮食8周,大鼠肝组织HE染色显示即有局灶性肝细胞脂肪变性,呈以小泡性为主的混合性脂肪变性,局部出现小叶内炎症细胞浸润;随着时间的延长,造模12周大鼠呈中-重度脂肪肝,部分脂滴形成大空泡,将细胞核挤压至一边,肝小叶结构破坏,肝细胞排列不规整,并伴大量肝细胞肿胀,部分呈气球样变,所有大鼠均可见到小叶内炎症,炎症细胞以单个核细胞为主,伴点状或小灶性坏死,治疗组上述病变减轻。 2.4 肝组织cd14阳性细胞计数结果 CD14表达对照组大鼠肝组织仅有少量细胞表达CD14抗原(10.30±2.20)个/高倍视野,主要位于肝窦内;造模8周模型组大鼠肝组织CD14阳性细胞数量已明显增多(20.00±3.00)个/高倍视野与对照组比较有统计学意义,12 周阳性细胞数显著增多(56.20±13.60) 个/高倍视野与对照组比较有显著性差异P0.01,阳性细胞主要也位于肝窦内,部分则呈灶型聚集;治疗组CD14阳性细胞数量(17.64±5.40、48.18±6.51) 个/高倍视野。 3 cd14与肝脏组织病理学的关系 实验结果发现在NASH动物模型第8周、12周门静脉ET水平明显升高,提示NASH伴有肠源性内毒素血症的形成,而腹主动脉血中ET水平与正常对照组无差异,可能是此时枯否细胞仍有一定的能力清除ET。该结果与范建高等的实验结果基本一致。CD14是脂多糖(LPS)或LPS-脂多糖结合蛋白(LBP)的受体以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白形式存在于单核巨噬细胞表面,其在介导ET引起的细胞活化过程中起启动作用。研究发现在8周、12周CD14表达逐渐增高,与肝组织病理学改变一致,其机制可能是LPS或LPS-LBP与CD14结合不断刺激肝脏枯否细胞产生许多炎症介质以及细胞因子,这些炎症介质