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酶联免疫吸附法检测hbsag的改进 血液过滤的四个要素的两年内法已被纳入2010年的新药店，其他elisa步骤将被废除。新药典强调ELISA两步法就是为了尽量避免ELISA一步法试剂盒钩状效应所致的假阴性问题, 确保抗原抗体有足够充分的接触时间, 强化痕量抗原 (抗体) 的检出效果, 以保障血液制品的安全使用。但目前的HBsAg两步法检测步骤仍存在一定不足, 报道如下。 1 材料和方法 1.1 hbeag和hbcab检测结果 所有样本均采自我院2011年4月—2012年3月的门诊及住院患者血清160份, 其中男103例, 女57例, 年龄1 d～86岁, 平均43岁, 将检测中发现HBeAg和HbcAb呈阳性的血清样本检测当日分离, 及时进行HBsAg检测。 1.2 试剂盒和试纸条 乙肝两对半 (HbsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb、HbcAb) ELISA试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司。艾康HBsAg胶体金试纸条, 购自杭州艾康生物技术有限公司, 均在有效期内使用, 严格按照说明书操作。洗板机:深圳汇松PW-812。酶标仪:芬兰Thermo公司WESCAN MK2酶标仪。 1.3 阳性比色 HBsAg检测的ELISA法严格按说明书进行操作, 采用双波长450/630 nm比色, cut off (COV) 值=0.1+阴性对照OD平均值, 样品OD值S/ COV ≥1.0者HBsAg为阳性结果。 2 elisa检测 有160份血清样本HBeAg和HBcAb同时阳性, 其中HBsAg有151例呈阳性, 9例为阴性。对这9份阴性血清经生理盐水1:1、1:3和1:7 稀释重新按ELISA二步法检测, 酶标仪450/630 nm比色结果如表1。 上述9份样本血清用胶体金试纸条进行复检, 样本1～6HBsAg均能呈阳性反应, 样本7～9呈阴性, 符合表1结果。另外对9份血清样本在检测HBsAg时进行了步骤改动, 一组加血清温育60 min后增加洗板5次, 再加入酶标志物。另外3组仍然按说明书步骤第1次温育60 min后不洗反应板分别加入酶结合物50、100、200 μl检测结果见表2。 3 elisa检测表面压力 ELISA是指以酶作为标志物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。其质量稳定, 重复性较好、快速简便、灵敏度高, 被实验室检测人员广泛应用。以前的HBsAg酶联检测试剂是一步法, 加血清50 μl后直接加相应酶结合物混合反应。现在测定HBsAg的ELISA试剂盒全部采用二步法.我科室先后试用了上海科华、英科新创、珠海丽珠三个厂家的乙肝表面抗原ELISA两步法试剂盒, 血清用量为75～100 μl不等, 均为加样后37℃温育60 min不洗反应板直接加相应酶标志物, 混匀37℃温育30 min后洗板, 加显色剂温育30 min用酶标仪450/630 nm比色。与先前的HBsAg一步法酶联检测试剂比较, 两步法增加了血清用量, 并增加了反应时间, 理论上提高了血清中痕量HBsAg的检出。但通过表1结果显示, 有部分HBeAg和HbcAb阳性的样本中其HBsAg结果为阴性结果, 血清经生理盐水稀释重新按乙肝表面抗原ELISA两步法检测, 原本6例HBsAg阴性结果为强阳性。分析其原因归结于HBsAg浓度过高反应板包被的固相HBsAb和酶标记HBsAb相对不足形成的“钩状效应”。其余3例HBsAg仍然为阴性结果, 为新生儿。其母亲血清表现HBsAg+HBeAg+HbcAb阳性, 新生儿血清HBeAg+HbcAb阳性可能来自母体, 未能确认是否感染乙肝病毒。 表2中增加酶结合物用量后相应样本测量OD值也有明显升高, 也证实了表1中酶标记HBsAb相对不足的分析。表2还显示在血清反应板温育60min后增加洗板这一步骤后, 其中6个HBsAg阴性结果转为为强阳性, 3例新生儿血清HBsAg仍然为阴性结果, 说明增加洗板这一步骤后可以有效解决HBsAg浓度过高出现的“钩状效应”, 或者说是解决了固相包被物与酶标志物相对不足的影响, 因此建议增加血清反应板温育60 min后的洗板程序, 或增加试剂单位固相包被物与相应酶标志物的数量, 对消除因HBsAg浓度过高形成的“钩状效应”有至关重要的意义。 综上所述, 现行的ELISA二步法检测乙肝病毒表面抗原仍没有有效消除因HBsAg浓度过高而形成的“钩状效应”。建议广大实验室工作人员特别是在血筛四项中单独检测HBsAg时密切注意可疑或弱阳性结果的判断, 及时稀释复检或自行增加第一步温育反应60 min后的洗板程序, 可以有效减少血清样本中HBsAg含量过高时“钩状效应”导致的假阴性而漏检。日常工作中尽可能地不单独检测HBsAg, 以检测乙肝五项为佳, HBsAg