双抗体夹心法与间接法测定抗原.docxVIP

双抗体夹心法与间接法测定抗原 elisa法测抗体 双抗体夹心法：（1）将特定的抗体与固相载体连接起来，形成固相抗体：去除未结合的抗体和杂质。②加受检标本:使之与固相抗体接触反应一段时间, 让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合, 形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。③加酶标抗体:使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。④加底物:夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。 双位点一步法:在双抗体夹心法测定抗原时, 如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体, 则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作, 缩短了反应时间, 如应用高亲和力的单克隆抗体, 测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 间接法测抗体:间接法是检测抗体最常用的方法, 其原理为利用酶标记的抗体检测已与固相结合的受检抗体, 故称为间接法。操作步骤如下。①将特异性抗原:与固相载体连接, 形成固相抗原:洗涤除去未结合的抗原及杂质。②加稀释的受检血清:其中的特异抗体与抗原结合, 形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后, 固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合, 在洗涤过程中被洗去。③加酶标抗体:与固相复合物中的抗体结合, 从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后, 固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体, 可用酶标羊抗人IgG抗体。④加底物显色:颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原, 可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。 竞争法:竞争法可用于测定抗原, 也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合, 因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下:①将特异抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。洗涤。②待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液, 使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原, 则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原, 则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合, 竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会, 使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原, 保温后, 酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。③加底物显色:参考管中由于结合的酶标抗原最多, 故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差, 代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡, 表示标本中抗原含量越多。 捕获法测IgM抗体:血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在, 后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法, 先将所有血清IgM (包括异性IgM和非特异性IgM) 固定在固相上, 在祛除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下:①将抗人IgM抗体连接在固相载体上, 形成固相抗人IgM。洗涤。②加入稀释的血清标本:保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。③加入特异性抗原试剂:它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。④加入针对特异性的酶标抗体:使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。⑤加底物显色:如有颜色显示, 则表示血清标本中特异性IgM抗体存在, 是阳性反应。 血浆标本加样 ELISA法操作中的每个环节对试验的检测结果影响较大, 如不按常规操作, 可以导致显色不符、花板等情况。 在试验工作中, 首先试剂要优良。实验室测乙肝两对半及丙肝抗体用的是厦门新创的试剂, 必须严格按照操作步骤进行操作, 同时做好室内质控、室间质评, 以严格的工作作风检验每一份标本, 才能保证检测质量。全自动酶标仪的应用, 对于实现ELISA标准化检测, 提高检测质量起到了重要作用。 选择试剂:要选择试剂质量优良的检测试剂, 严格按照说明书进行操作, 操作前将试剂从冰箱冷藏格取出, 在室温下平衡30～60分钟。 加样:标本为血清时, 最好待血清在乳胶管中5分钟彻底凝固后, 再用4000转/分钟离心5分钟, 使血清和血球、纤维蛋白完全被凝胶分开;若标本为血浆, 必须使用含抗凝剂血液标本收集管, 采血后必须立即颠倒混合5～10次, 放置一段时间后, 用3000转/分钟离心15分钟;若几天内检测, 可放在2～8℃冰箱中, 若要久置贮存, 则置于-20℃的低温冰箱内 (加样后及时放入37℃水浴箱, 加酶结合物后用吸水纸在加样板表面轻拭吸干, 标本较多时, 分批加样测定) 。如果血清或血浆标本分离不好即进行加样, 加入的血清易出现凝固, 影响阴阳性检测;手工操作中, 加样板过多造成加样后放入37℃水浴箱前等待时