小曲清香型白酒手工和机械化酿造过程中酒醅理化及微生物群落演变的差异性分析.docxVIP

? ? 小曲清香型白酒手工和机械化酿造过程中酒醅理化及微生物群落演变的差异性分析 ? ? 晏 培，谭 壹，李登勇，邵家艳，刘中利，李 骥，李雪荧 （重庆江记酒庄有限公司，重庆江津 402289） 小曲清香型白酒是我国白酒酿酒历史上最古老的酒种之一，其以粮谷为主要原料，小曲为糖化发酵剂，经蒸煮摊晾、培菌糖化、续糟发酵、蒸馏、陈酿、勾兑而成，出酒率高，发酵周期短，以乙酸乙酯为主体香，其风味特点是“清香纯正、自然协调、醇甜柔和、后味爽净”。 目前，传统白酒酿造大多为手工酿造，过程中存在设备落后、劳动强度大、生产效率低、工艺控制粗放等问题。随着技术的创新和发展，酿酒行业开始采用机械化、自动化、智能化和信息化等手段不断地促使传统白酒酿造模式升级。机械化酿酒虽然工艺流程与传统工艺相似，但因其独特的酿造设备和环境，导致生产的基酒与传统工艺相比，在风味组成上有较明显差异。解析手工和机械化酿造基酒差异的形成原因，将有助于机械化酿造的稳定优质生产。 微生物作为白酒发酵的核心，其群落结构的改变会驱动风味物质组成发生变化。微生物生长代谢引起酒醅理化指标呈现一定规律的变化，同时酒醅成分改变反促微生物群落结构及生存环境的相应改变，使优势菌群逐渐呈现稳定状态，进而影响酒醅中风味物质的代谢和积累。因此，揭示小曲清香型白酒手工与机械化酿造过程中，酒醅理化指标和微生物的变化规律及其差异，有助于进一步了解小曲清香型白酒发酵过程中微生物变化及风味产生机理。 本试验以小曲清香型白酒手工和机械化酿造车间酒醅为研究对象，基于高通量测序数据分析不同发酵时期酒醅发酵过程中微生物动态变化，并结合酒醅理化参数的变化，揭示小曲清香白酒手工和机械化酿造过程中微生物及环境因子的变化规律，以及对酒体风味变化的影响，以期指导实际生产，为机械化工艺改进和酒质的不断提升提供技术支撑。 1 材料与方法 1.1 材料、试剂及仪器 酒醅：取自重庆江记酒庄有限公司手工和自动化酿酒车间。 耗材及试剂：细菌、真菌培养基购于国药集团化学试剂北京有限公司。菌株DNA 提取、16S rDNA 片段和真菌ITS 扩增所用的酶、Marker、dNTPs、Buffer 等购于生工生物上海股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。 仪器设备：Illumina Miseq PE300 高通量测序平台；Vortex振荡器，德国IKA公司。 1.2 实验方法 1.2.1 取样方法 小曲清香型白酒生产分为培菌和窖内发酵两个阶段；培菌1 d，手工车间窖内发酵10 d，自动化车间窖内发酵20 d。手工车间选取培菌前、培菌后、发酵2 d、4 d、6 d、出窖样品，自动化车间选取培菌前、培菌后、发酵2 d、4 d、6 d、10 d、15 d、出窖样品。根据等距采样法，分别在酒窖上、中、下层等距采集3 个位点的样本。样本采集后混合均匀，并分装于无菌袋封装标记，于-80 ℃冰箱中保存。 1.2.2 高通量测序分析方法 酒醅基因组DNA 直接从样本中提取，利用Illumina Miseq PE300 高通量测序平台测序。细菌的16S rRNA V3—V4 扩 增 引 物 为 338F（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R（5-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3），真菌扩增引物为ITS3（5-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）。PCR反应体系：12.5 μL 2 × Taq PCR MasterMix，3 μL BSA(2 ng/μL)，2 Primer(5 μM)，2 μL 模板DNA，和5.5 μL ddHO。反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，32个循环；72 ℃延伸10 min终止。扩增序列通过Illumina MiSeq 平台进行Paired-end 测序，下机数据经过QIIME（v1.8.0）软件过滤、拼接、去除嵌合体，去除得分低于20 分、碱基模糊、引物错配及测序长度小于150 bp的序列。 经过上述步骤后，将标签分组具有97 %序列相似性的高质量OTU 序列，细菌得到的每个OTU 代表序列比对silva 数据库和NT 数据库，真菌得到的OTU 代表序列比对UNITE 数据库和NT 数据。最后再通过人工进行检查以获得物种信息。 2 结果与分析 2.1 手工和机械化酿造基酒的理化及风味成分分析 对手工和机械化酿造基酒的理化和主要风味物质进行对比分析，结果见表1。 表1 手工和机械化酿造基酒的理化及风味成分对比 由表1 可知，在基酒理化指标方面，机械化酿造基酒的总酸和总酯均高于手工，但差异不明显。在基酒主要风味成分方面，机械化酿造基酒的乙缩醛含量显著高于手