尼古丁诱导人肠道上皮细胞自噬水平的研究.docxVIP

? ? 尼古丁诱导人肠道上皮细胞自噬水平的研究 ? ? 高茜，杨斌，管莹，毕品端，黄海涛，曾婉俐，向海英，刘欣，米其利，李雪梅* 1 云南中烟工业有限责任公司，云南省昆明市高新区科医路41号，650024; 2 昆明医科大学第一附属医院，云南省昆明市西昌路295号，650032 炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一类慢性、易复发的消化系统疾病，主要包括溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）和克罗恩病（Crohns disease，CD）[1]。由于饮食结构的变化，IBD在我国的发病率呈现不断升高趋势[2]。目前，IBD尚无有效的根治手段，但多数患者可通过药物治疗使病情得到有效缓解。烟碱，俗名尼古丁，是一种从茄科植物（茄属）中提取出的三级胺生物碱，也是烟草的重要成分[3]，已被用作溃疡性结肠炎患者的治疗剂[4]。咀嚼尼古丁口香糖可有效控制轻度至中度结肠炎的临床病症[5]。尽管如此，尼古丁的作用机制尚不清楚。 自噬是一种特殊的细胞内吞噬现象，能够主动吞噬细胞内的受损细胞器、蛋白质等内容物，降解成氨基酸、核糖等代谢物重新用于生物合成和供能，进而维持细胞稳态[6]。在消化系统疾病最常发生的内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）中，自噬通过消化蛋白聚集物和错误折叠蛋白维护内质网功能，限制ERS诱导的细胞凋亡，从而保护消化道细胞[7]。研究证实自噬是消化道炎症反应的一个重要调节靶点。一项GWAS分析显示自噬基因ATG16L1的多态性位点与IBD的发病率存在相关性[8]。这些证据说明自噬在消化系统疾病中扮演重要角色。本研究的主要目的是观测尼古丁对上皮细胞自噬的诱导作用及分子机制，了解该机制将有助于为IBD的治疗和预防带来新的策略。 1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器 DMEM培养基、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素、lipofectamine 2000均购自美国Thermo公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒（Dojindo，日本）；预染蛋白Marker（Thermo公司，美国），兔抗人LC3、Beclin1、p62、β-actin抗体（SantaCruz公司，美国）；BCA蛋白浓度检测试剂盒（Thermo公司，美国），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS）（碧云天公司，江苏） 酶标仪（Tecan，Mannedorf，Switzerland），电泳及转移系统（Bio-Rad公司，美国），Odyssey扫描仪（LiCor公司，美国），分光光度计（Jenway公司，英国），荧光显微镜（Olympus公司，日本）。 1.2 实验方法和条件 1.2.1 人肠道上皮细胞培养及处理 人肠道上皮细胞（Hunman intestinal epithelial cells，hIECs）来源于中国科学院昆明动物研究所。使用含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃下5%CO2细胞培养箱中培养，每3天常规换液，待细胞增殖至板底面积90%时胰酶消化传代，第4代hIECs用于后续实验，培养基为含10%胎牛血清的DMEM。 1.2.2 CCK8检测细胞增殖情况 使用CCK8试剂盒并根据使用说明测定细胞活力。将hIECs在96孔板中培养以达到所需的汇合。将细胞与不同浓度的尼古丁（0、2.5、5和10 μM）一起孵育。在尼古丁处理24小时后，向每个孔中加入10 μlCCK-8溶液。再将细胞在37℃下孵育2小时。使用酶标仪（Tecan，Mannedorf，Switzerland）在450nm处读取吸光度。 1.2.3 Western-blot检测自噬标志蛋白和mTOR通路相关蛋白的表达 取生长状态良好的hIECs，以每孔2×105个细胞的密度接种于六孔板中，待细胞生长至80%后分别给予0、2.5、5和10 μM的尼古丁作用24 h，PBS洗涤后每孔加入120 μL含1 mM蛋白酶抑制剂的细胞裂解液（ridio-immunoprecipition assay，RIPA），在冰上充分裂解后刮取细胞。将细胞裂解混合物移至EP管中，4 ℃、12 000 r离心15 min。收集上清，采用BCA 法测定蛋白质浓度。每孔进样总蛋白30 μg，进行SDS蛋白电泳。电泳分离蛋白后，采用恒流200 mA的湿转法将蛋白转移至PVDF膜上。5% 脱脂牛奶室温封闭1 h后，孵育一抗（LC3B，1:300稀释；Beclin1，1:500稀释；p62，1:500稀释；β-actin，1:1000稀释），4 ℃过夜。室温孵育二抗2