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空间诱变粤香占和青华占高代品系抗水稻穗颈瘟的ssr多态性分析 由真菌马格拉姆引起的水稻水稻灾害是全球毁灭性疾病之一，往往会造成严重的经济损失。这是阻碍水稻高产和稳产的主要原因之一。抗病性育种和使用是最经济有效、最环保的防治策略。世界各主要产稻国家都选育了许多抗病品种和中间亲本,获得大面积推广种植和应用。我国自20世纪60年代开始注意品种抗性的研究,选育出广陆矮、珍籼97和窄叶青等抗性品种,20世纪70年代以来筛选出红脚占等抗源和珍龙13等许多直接利用的品种,但是许多抗病品种在推广几年之后就丧失了抗性。因此,如何寻找新抗源、改良品种的抗病持久性是当前稻瘟病抗病育种的关键。 空间诱变育种是近十多年来涌现出来的创造新种质和培育新品种的一种新方法,因其可以获得在地面上用其他育种方法难以得到的罕见突变体,为获得新的抗病种质资源提供了快速有效的途径。空间诱变稻瘟病抗性变异的机制是复杂的,需要系统地从不同水平上进行研究。目前国内在培育抗稻瘟病新品种和选育新抗源方面做得较多,而对诱变品系的生理生化和分子生物学方面的研究较少。作者前一阶段研究已对经过高空气球搭载后的水稻诱变品系进行了稻瘟病抗谱测定,证明空间诱变可以获得对稻瘟病苗叶瘟表现高抗的抗病种质,本论文报道了空间诱变品系的穗颈瘟鉴定试验结果,并采用SSR标记技术对水稻空间诱变抗病材料进行分子标记研究。 1 材料和方法 1.1 应用抗诱变株的筛选及筛选 将高感稻瘟病品种粤香占和青华占品种的种子分别于1998年和1999年利用高空气球搭载进行空间诱变,诱变后的种子经过田间单株种植,对特大穗、特高产、特优质、高分蘖等农艺性状表现优异的突变株进行选育,并经过多代(6代以上)繁殖,最终获得20份农艺性状优异的粤香占诱变品系和35份青华占诱变品系。从中随机选择11份粤香占和10份青华占诱变品系作为本研究的材料,原种粤香占和青华占做对照。 1.2 叶疫和穗颈当前发病情况 将空间诱变品系与原种对照同时种植于稻瘟病代表性病圃,即粤北山区的杂交稻稻区从化吕田,该病圃为稻瘟病常发区。每品种(系)种5行,每行5丛,周边插植2行高感稻瘟病品种CO39。分期调查叶瘟和穗颈瘟发病结果。穗瘟调查病级分为0～9级,其中0级:无病;1～2级:发病率5%;3～4级:发病率5.1%～10.0%;5级:发病率10.1%～25.0%;6～7级:发病率25.1%～50.0%;8～9级:发病率50.1%～100.0%。将病级为0～2级的定为高抗,3～4级的为抗病,5级的为中抗至中感,6～7级为感病,8～9级为高度感病。 1.3 研磨石英砂、去干活性 水稻总DNA的提取按Zheng等的简易SDS抽提法稍加修改进行。方法如下:取水稻苗期幼叶2～3片于研钵中,加400 μL SDS抽提液(200 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5、 25 mmol/L NaCl、0.5%SDS),再加入少许石英砂,研磨成绿色浆状,转移至2 mL离心管中,用400 μL抽提液洗净研钵,洗液一同倒入离心管中,放置约1 h。加入氯仿/异戊醇(V ∶V=24 ∶1)约1 mL,振荡45 min,充分混匀后于14 000 r/min离心5 min,上清液转移到另一1.5 mL离心管中,加入等体积冰冻乙醇,-20℃下放置15 min析出DNA,14 000 r/min离心3 min,去上清液,用75%乙醇漂洗,适当风干,加200～300 μL TE(10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、 1 mmol/L EDTA)溶解。 1.4 pcr扩增 所用引物根据Cornell大学(网址:/rice/microsat)公布的序列,由上海生工公司合成,共150对,均匀地分布于水稻的12条染色体上。PCR反应在PE9700热循环仪上进行。PCR反应体系(20 μL)中含有:1×PCR buffer(50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.3,1.5 mmol/L MgCl2,0.1%明胶),1UTaqDNA聚合酶,50～100 ng模板DNA,0.15 umol/L引物,0.2 mmol/L dNTP。反应程序为94℃预变性5 min,(94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min)35个循环,72℃再延伸5 min。扩增产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,0.1% AgNO3染色观察。 1.5 相关分析 采用SPSS 13.0软件分析粤香占和青华占诱变品系的抗病性与微卫星多态性频率的相关性。 2 结果分析 2.1 空间诱变对自身抗性的影响 粤香占和青华占2个水稻品种的种子经过高空气球搭载后,选育出丰产、株型、分蘖力等农艺性状表现比原种提高的空间诱变高代(6代以上)品系,在上阶段研究中,作者采用36个广东