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羟自由基的新电化学检测方法 在生物体内，必要氧化还原反应产生的羟基自由基可能会导致饱和脂肪酸的过氧化反应、膜结构的破坏和各种疾病。因此，羟基自由基的检测对研究自由基的生物作用以及羟基自由基活性物质的开发具有重要意义。羟自由基的检测方法有电子自旋共振(ESR)、高效液相色谱(HPLC)和化学发光等。近年来二甲亚砜作为羟自由基的探针试剂的研究逐渐引起了人们的关注。作者基于Fenton反应产生羟自由基氧化二甲亚砜,产生的甲醛与乙酰丙酮、氨发生Hantzsch反应,产物3,5＿二乙酰基＿1,4＿二氢吡啶在-1.20 V(vs SCE)处有一灵敏的二阶导数极谱波,建立了测定羟自由基及其清除的一种新电化学方法,测定了几种清除剂的IC50(清除率为50%时清除剂的浓度)以及与羟自由基反应的反应速率常量,其结果与文献值接近。该法仪器简单,操作简便,是一种值得推广的测定羟自由基的方法。 1 实验部分 1.1 -edta-nh4ac-11的溶液 MP＿1型溶出分析仪(山东电讯七厂),三电极系统:滴汞电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极。 Fe(Ⅲ)-EDTA(摩尔比1∶1)溶液:0.004 mol/L;DMSO:0.01 mol/L;H2O2:0.006 mol/L;NH4Ac:0.5 mol/L,用0.5 mol/LNaOH与0.5 mol/LHCl调节pH为5.8;乙酰丙酮(0.4 g/L):每天新配制;抗坏血酸(VC):0.012 mol/L,每天新配制。实验室用水均为二次蒸馏水。 1.2 实验方法 1.2.1 b-6-甲基-1,4-二氢-3,5-o-edta摩尔比、5. 在5 mL的反应溶液中,含KH2PO4-Na2HPO4(50 mmol/L,pH7.4)、DMSO(200μmol/L)、Fe(Ⅲ)-EDTA(摩尔比1∶1,80μmol/L)、H2O2(120μmol/L)、VC(240μmol/L),混合溶液于37℃水浴反应15 min。 1.2.2 还原峰电流的测定 上述溶液中加入4 mLNH4Ac和1.5 mL乙酰丙酮(0.4 g/L),溶液最终pH为6.2,摇匀,于60℃水浴反应20 min,取出后流水冷却,在示波极谱仪上,起始电位为-0.90 V,在-1.20 V处记录二阶导数还原峰电流。 2 结果与讨论 2.1 羟自由基氧化对甲醛极谱图的影响 按实验方法绘制反应产物的极谱图如图1所示。反应产物在-1.20 V处产生一灵敏的二阶导数极谱波。在pH为6.2的NH4Ac溶液里加入适量的甲醛及乙酰丙酮,在60℃水浴中加热20min后得到的极谱图与本文提出的实验方法所得极谱图相同说明被反应产生的羟自由基氧化后产生了甲醛。降解反应完成后加入乙酰丙酮直接测定,观察不到相应的极谱波,当放置过夜或加热后,才能在-1.20 V处观察到相应的极谱波。综合上述实验结果,该极谱波不是DMSO降解产物甲醛直接在滴汞电极上反应而产生的,而是甲醛、氨和乙酰丙酮反应生成的3,5＿二乙酰基＿1,4＿二氢吡啶在滴汞电极上产生的四电子不可逆还原波。 2.2 试验条件的选择 2.2.1 ph值的影响 pH在4.3～7.2之间,峰电流随pH升高逐渐增大,然后降低,当pH=6.2时,峰电流达到最大;峰电位Vp随pH逐渐增加而线性负移,回归方程为Vp=-0.77-0.065×pH,表明质子参加了电极反应(图2)。 2.2.2 羟基自由基vc的用量 VC在一定浓度下可将Fe(Ⅲ)-EDTA还原成Fe(Ⅱ)-EDTA,因而可以增加羟基自由基的产生量,但VC本身也是自由基的一种清除剂,如果用量过大,会造成自由基产生量的减少。实验选择VC浓度为240μmol/L(图3)。 2.2.3 o的加入 Fenton体系自身可以产生H2O2,但额外H2O2的加入可以提高自由基的产生量。实验结果表明,H2O2的浓度大于80μmol/L时峰电流最大且基本稳定,本实验选择120μmol/L。 2.2.4 fe3+-edta溶液用量的确定 改变Fe(Ⅲ)-EDTA(摩尔比1∶1)的用量,当溶液中Fe3+-EDTA的浓度大于60μmol/L时峰电流达到最大且基本稳定,实验选择Fe3+-EDTA浓度为80μmol/L。 2.2.5 二苯基乙醇的使用 0.4 g/L的乙酰丙酮用量为1～2mL时,峰电流达到最大且基本稳定,实验选用1.5 mL。 2.2.6 非mso时间限制 实验结果表明,DMSO降解时间为12～25 min时峰电流达到最大且基本稳定,实验选用15 min。 2.2.7 反应时间及温度 Hantzsch反应温度在55～70℃、反应时间在15～30 min时,峰电流达到最大且基本稳定,实验分别选用反应温度为60℃,反应时间为20min。 2.2.8 清除剂的稳定性 当没