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五种黄酮类化合物清除自由基作用的研究 天然黄酮酸是自然界广泛存在的酚类抗剂之一，其氧化活性与自由基去除活性密切相关。目前，关于黄酮类化合物提取自由基的报道主要集中在对其疗效的研究上，而对其结构和性能关系的研究较少。因此，作者将三苯基自氧化物-2的提取过程研究了东苏科和黑沙艾酒中的七种黄酮类化合物-2，并对结构和性能进行了解释。 1 实验部分 1.1 仪器厂仪器厂 JP-303型极谱仪(中国成都研究所仪器厂);pH-1型酸度计(上海大中分析仪器厂);邻苯三酚(遵义市第二化工厂)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)-HCl缓冲溶液(pH=8.2). 所有试剂均为分析纯,水为二次蒸馏水. 实验温度均为室温. 本实验所用黄酮类化合物的制备见文献,纯度均达97 %以上,其结构见图1. 1.2 阶导数极谱波 超氧阴离子自由基(Ο?2)可通过邻苯三酚在pH=8.2的Tris-HCl缓冲溶液中自氧化产生. 本实验在5.7 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)中加入0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚,0.2 mL无水乙醇,总体积为6 mL,迅速摇匀,在JP-303型极谱仪上记录了该体系在1～12 min内的二阶导数极谱波,观测-0.91 V处的二阶导数还原波随时间的变化情况. 扫描电位:-0.80 ～ -1.60 V;扫描速度:500 mV/s. 邻苯三酚在4 min时出现最大电流(见图2). 实验先测出5.7 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)中加入0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚,0.2 mL无水乙醇,总体积为6 mL,反应4 min时的峰电流Ip0,然后再测定在5.7 mL 50 mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)中加入0.2 mL 3.5×10-4mol/L样品的无水乙醇溶液,0.1 mL 6 mmol/L邻苯三酚,总体积为6 mL,反应4 min时的峰电流值Ip1,其清除率为:S= [(Ip0-Ip1)/Ip0]×100% 2 结果与讨论 2.1 阶导数波:ep 邻苯三酚在碱性水溶液(Tris-HCl体系,pH=8.2)中很快自氧化产生Ο?2,自氧化中间产物在-0.91 V,-1.12 V,-1.40 V等处均产生二阶导数波.Ep= -0.91V处的极谱波随时间增加,其峰电流先增大后减小;Ep= -1.12 V处的峰电流变化没有规律;Ep= -1.40 V处的峰电流随时间增加而增加. 本实验选择-0.91 V处的极谱波作为检测电位点,在极谱峰线性增长范围内记录其自氧化4 min时的峰高,通过比较加入相同浓度的样品后对该峰的影响大小来考察其对Ο?2清除能力的强弱. 2.2 有邻位羟基 七种天然黄酮类化合物清除超氧阴离子(Ο?2)的作用强弱不同,其结果见表1,这种差异与它们本身结构有关. 从表1数据并结合样品的结构可得出以下结论:七种能清除Ο?2的黄酮类化合物都具有酚羟基结构,提示酚羟基是清除Ο?2的主要活性基团. 并且通过比较样品1和其它样品对Ο?2清除率的效果,从图1和表1可以看出:羟基数目越多,对Ο?2清除的效果越好. 样品3、样品4、样品7与样品5均含有三个酚羟基. 样品3、样品4、样品7的B环上具有邻位羟基(3′,4′位羟基),它们清除Ο?2的效果比样品5更有效,说明B环上3′,4′位羟基清除Ο?2能力较强. 理论上黄酮类化合物A环、B环和C环形成大的p-π共轭体系,具有强烈的斥电子作用,B环上酚羟基处于共轭体系之中,易脱氢提供电子,与自由基结合,从而达到清除自由基的作用. 酚羟基的电离取决于酚羟基的极性. 显然,氧上的电子云密度越小,则对共价键的电子吸引力越强,则氢就越易电离. 张金桐等研究了黄酮类化合物的生物学活性与电子结构关系,结果表明,C3′-OH上的氧的电子密度最小,故其发生电离的能力最强. B环的4′-OH的存在可以延长黄酮体的共扼体系,使整个分子的电子云分布离域,有助于黄酮体化合物形成相对稳定的自由基中间体. 同时,4′-OH供氢后易与3′位的氧共享3′-OH的氢而形成分子内氢键,从而进一步提高3′,4′-邻二羟基黄酮自由基的稳定性. 样品6,7与样品1,3相比,它们的区别在于前者C2和C3之间为双键,而后者C2,3双键被氢化,但它们对Ο?2的清除能力为:6﹥1,7﹥3,说明C2-C3双键对黄酮类化合物的活性有一定影响. 从理论上分析,C2,C3双键扩大了共轭体系,有利于酚羟基阴离子的稳定化. 而一旦C2,C3双键被氢化后,缩短了共轭体系,改变了分子的平面结构,降低了酚羟基的电离作用,不利于黄酮类物质的抗氧化活性. 样品3的7-OCH3被Glc(样品4)取代后,活性有所下降,原因可能是糖基体积较大,产生空间位阻效应从而导致酚羟基